Esse método pode ajudar a entender questões-chave no campo de interação célula-celular, como quais receptores mediam a adesão ou reconhecimento em contatos célula-célula e se ligands específicos desencadeiam suas interações. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite investigar tais interações diretamente em células vivas sem necessidade de fixação celular ou interrupção. Embora este método seja usado para investigar interações entre células cultivadas, ele também pode ser aplicado a outros sistemas de vesículas mono-membranas ou mesmo pequenos organismos modelo.
Geralmente, indivíduos novos neste método devem verificar se sua amostra é estável o suficiente para permitir a aquisição ao longo de alguns minutos, inspecionando cuidadosamente o movimento celular e variações lentas de sinal. Primeiro, semear o número apropriado de células em pelo menos quatro poços de uma placa de seis poços por dia antes da transfecção. Cultura as células a 37 graus Celsius 5% dióxido de carbono no DMEM médio suplementado com 10% FBS e 1%L-glutamina.
Para realizar um experimento básico transfect plasmids para a proteína de interesse fundido a uma proteína verde ou amarela fluorescente e uma proteína fluorescente vermelha em poços separados. Após quatro horas, remova o meio de crescimento e lave cada poço suavemente com um mililitro de PBS suplementado com magnésio e cálcio caindo PBS na borda do poço para evitar o descolamento das células durante a lavagem. Em seguida, remova o PBS.
Adicione aproximadamente 50 microliters de solução EDTA para soltar-se em cada poço para facilitar o descolamento das células. Depois de incubar a 37 graus Celsius por dois minutos, agite lentamente a placa de seis poços lateralmente para desprender as células. Em seguida, adicione 950 microliters de meio de crescimento a cada poço e resuspense as células, pipetando algumas vezes para cima e para baixo, desprendendo todas as células do fundo do poço.
Certifique-se de que as células são resuspended adequadamente e separados uns dos outros, verificando visualmente a ausência de grandes agregados celulares após a ressuspensão. Transfira a solução celular de um poço para o poço correspondente. Misture suavemente por pipetting algumas vezes para cima e para baixo.
Em seguida, semear as células mistas em um prato de fundo de vidro de 35 milímetros e cultivar as células semeadas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por um dia. No software de microscópio confocal de varredura a laser configurar o caminho óptico. Para evitar o crosstalk espectral, selecione duas faixas separadas para excitar e detectar mEGFP ou mEYFP e mCherry ou mCardinal sequencialmente e selecione faixas do Switch em todas as linhas.
Para a detecção use filtros apropriados para ambos os canais. Coloque o prato contendo as células mistas no suporte da amostra. Depois de esperar 10 minutos para garantir o equilíbrio da temperatura e reduzir a deriva do foco, concentre-se nas células usando a luz de transmissão no menu Localizar.
Procure por um par de células vermelhas e verdes em contato entre si. Em seguida, selecione um caminho de varredura perpendicular para contato célula-celular usando o botão Crop. Zoom para alcançar um tamanho de pixel de 50 a 200 nanômetros e selecione Linha no modo Scan.
Defina o tamanho do quadro para 128 por um pixel. Defina a velocidade de varredura para o valor máximo permitido. Em seguida, definir ciclos para 100.000 a 500.000.
Depois disso, escolha os poderes laser apropriados. Ajuste os detectores para o modo de contagem de fótons. Pressione o Experimento Start para iniciar a aquisição.
Exporte os arquivos de dados brutos para uma imagem TIF RGB em formato de dados brutos. Este arquivo conterá um kymograph com os dados do canal verde e vermelho no canal denominado G e R da imagem, respectivamente. Em seguida, importe o arquivo TIF com o software de análise apropriado e prossiga para realizar a análise.
Alinhe as linhas executando uma média de tempo de segmento com blocos de 500 a 1000 linhas. Determine a posição da membrana em cada bloco. Em seguida, mude todos os blocos para a mesma posição lateral.
Resumindo todas as linhas alinhadas ao longo do eixo temporal e ajuste o perfil de intensidade média usando uma função gaussiana. Defina os pixels correspondentes à membrana como todos os pixels dentro de mais ou menos 2,5 sigma da posição da membrana, e resumir a intensidade desses pixels em cada linha obtendo um único valor de sinal fluorescente para cada ponto de tempo. Se for observado branqueamento de foto, aplique uma correção de branqueamento, encaixando a série temporal de fluorescência da membrana com uma função exponencial dupla e aplicando a fórmula de correção apropriada.
Calcule as funções de auto e correlação de acordo com as equações apropriadas. Para melhorar a confiabilidade da análise e evitar artefatos realizar os cálculos para 10 a 20 segmentos iguais da medição total. Inspecione as séries temporências de fluorescência e as funções de correlação em cada segmento e remova segmentos claramente distorcidos.
Finalmente, média de todos os segmentos não distorcidos. Ao analisar seus dados, inspecione cuidadosamente as séries temporâneas de intensidade e as funções de correlação de cada segmento para evitar distorções, por exemplo, devido a vesículas intracelulares na periferia da membrana. Uma imagem de intensidade das células HEK 293T expressando myristolyated-palmitoylated-mEYFP ou mCardinal é mostrada aqui.
Observou-se uma correlação cruzada relativa perto de zero, enquanto as funções de autocorrelação mostram tempos característicos de decomposição de 10 a 20 milissegundos para a difusão de myristolyated-palmitoylated-mEYFP e mCardinal na membrana plasmática. As funções de correlação cruzada das medidas sFCCS das células HEK 293T expressando heterodimer miristolyated-palmitoylated-mCardinal-mEYFP tiveram amplitudes positivas e mostraram tempos de decomposição semelhantes à função de autocorrelação. As medições de sFCCS em contatos célula-celular entre células aplp1-mEYFP e APLP1-mCardinal resultou em uma correlação relativa positiva de 0,45.
As funções de correlação sFCCS obtidas a partir de medições em clusters APLP1 em contatos célula-célula mostraram dinâmica fortemente reduzida como evidente de grandes tempos de decadência nas oscilações em grandes tempos de defasagem. Após a adição de íons de zinco, a correlação cruzada relativa aumentou para um valor médio de 0,8. Além disso, o brilho molecular aumentou significativamente de pequenos oligômeros para multimers maiores, consistindo de 10 a 50 monômeros em cada célula.
Instabilidades transitórias podem resultar em uma função de correlação cruzada com valores negativos ou uma alta correlação cruzada falsa positiva. As funções de correlação correspondentes normalmente se desviam fortemente das da maioria dos segmentos. Como uma abordagem complementar ao número de correlação cruzada sFCCS e brilho pode ser usado para detectar interações proteína-proteína.
Ao tentar este procedimento é importante lembrar que a mistura de células transfeinadas é um passo crítico. Misture suavemente as células e otimize a eficiência de transfecção para aumentar a chance de encontrar células vermelhas e verdes em contato. Após seu desenvolvimento, essa técnica tem sido utilizada por pesquisadores no campo da imunologia para explorar as interações de moléculas de sinalização em sinapses imunológicas.
