שיטה זו מאפשרת ליצור מספר גדול של בני ניצני כבד אנושיים ותאים דמויי hepatocyte עם טוהר גבוה. היכולת ליצור את תאי הכבד האלה יכולה להיות חשובה לרפואה רגנרטיבית ולתחומים אחרים. על ידי שליטה במסלולי האיתות ההתפתחותיים לקידום בידול הכבד ודיכוי היווצרותם של סוגי תאים לא רצויים, שיטה זו מאפשרת ייצור יעיל של בני ניצני כבד אנושיים ותאים דמויי hepatocyte על ידי שישה ו -18 ימים של בידול בהתאמה.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הטוהר הגבוה של תאי הכבד האנושיים הנוצרים. כדי להיות הליך זה, להוסיף 50 מיליליטר של IMDM לבקבוק חרוט המכיל בר ערבוב. מחממים את המדיום עד 50 מעלות צלזיוס ומוסיפים 0.5 גרם של PVA תוך ערבוב רציף להכנת מלאי PVA בריכוז של 10 מיליגרם למיליליטר.
לאחר מכן, להסיר את פתרון PVA משטח החימום ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר. לאחר שהפתרון מקורר, מסננים אותו באמצעות מסנן מיקרומטר סטרילי של 0.2. הכן את ה- CDM2 וה- CDM3 על-ידי שילוב ה- PVA המסונן עם רייגנטים אחרים כמפורט בטבלה אחד מפרוטוקול הטקסט.
השתמש במסנן מיקרומטר סטרילי של 0.2 כדי לסנן את כל המדיה. לאחר מכן, הכן את אמצעי ה- Media הבסיסי הנותר, CDM4 ו- CDM5, כמתואר בטבלה אחד מפרוטוקול הטקסט. כדי להכין את מדיום ההידול, הפשר תחילה את המולקולות הקטנות הקפואות ו/או גורמי הגדילה בטמפרטורת החדר.
יש להוציא את הכמות הנדרשת של מדיום הבסיס ולהוסיף את המולקולות הקטנות וגורמי הגדילה שצוינו למדיום הבסיס בריכוזים המתאימים. יום לפני השימוש, להפשיר את המטריצה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, לדלל את המטריצה ביחס של 1 עד 100 על ידי הוספת 500 microliters של מטריצה לתוך 50 מיליליטר של DMEM קר.
פיפטה מטריצה מדוללת לתוך המספר הנדרש של בארות באמצעות נפח מספיק של פתרון כדי לכסות את פני השטח של באר. מעבירים את הצלחת מצופה המטריצה לאנקובטור ב-37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות לפחות. מיד לפני הזריעה, שאפו את פתרון המטריצה הנותר מה בארות מצופות.
לאחר מכן, שאפו את המדיום מצלחת תרבות hPSC קונפלנטית ברובה והוסיפו סוכן דיסוציאציה שנרכש מסחרית, ודאגו להשתמש בדיוק מספיק כדי לכסות את פני השטח שבהם התאים גדלים. הדגירה hPSCs בסוכן דיסוציאציה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות או עד כמה מושבות להתחיל להתנתק. לאחר מכן, הוסף DMEM ו- F-12 כדי לדלל את סוכן הדיסוציאציה.
השתמש פיפטה סרולוגית חמישה מיליליטר בעדינות pipette למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לשטוף את כל התאים מפני השטח של באר. לאסוף את התאים הבודדים המתווסכלים בצינור חרוט 50 מיליליטר לדלל עם DMEM ו- F-12 לפי הצורך. צנטריפוגה צינור זה של hPSCs שנאספו ב 350 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות כדי גלולה את התאים.
בזמן ההמתנה לצנטריפוגה, שאפו את המטריצה מהצלחת שבה יזרעו את ה- hPSCs. הוסף כמות מספקת של מדיית mTeSR ל בארות נמען כדי לכסות אותן. כאשר הצנטריפוגה הושלמה, בזהירות שאפו את העל-טבעי, והשאירו את ה- hPSCs המוגלתיים בתחתית הצינור הקונטי.
תן מחדש את גלולת התא ב- mTeSR בתוספת מיקרומולר אחד של Thiazovivin המתקבל מסחרית. באמצעות פיפטה P1000, בעדינות triturate פעמיים עד שלוש פעמים כדי להשתמש מחדש באופן שווה את גלולת התא לתוך השעיה תא יחיד. מיד פיפטה 10 microliters של ההשעיה התא לתוך hemocytometer ולספר את מספר התאים.
כוונן את עוצמת הקול של hPSCs לשימוש חוזר עם mTeSR בתוספת Thiazovivin כדי להשיג את ריכוז התא הרצוי עבור ציפוי. לאחר מכן, לנער את הצלחת בתבנית צלב מספר פעמים כדי לוודא כי התאים מופצים באופן שווה. לאחר hPSCs כבר מצופה לפחות 24 שעות, להשתמש במיקרוסקופ ניגוד פאזה כדי לבדוק את המורפולוגיה של התאים עם דגש ספציפי על הקוטר של מושבות hPSC מצופה.
לאחר מכן, הכן את אמצעי ההתברות של APS ביום הראשון כמפורט בטבלה 2 של פרוטוקול הטקסט. יום אחד לאחר הזריעה, שאפו את ה-mTeSR בתוספת תיאזוביבין מה-hPSCs המצופים ושטפו אותם בקצרה עם מדיית IMDM. לאחר מכן, הוסף מדיום יום אחד ל- hPSCs.
תקליטו את הזמן ותמקם את התאים בחזרה באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס. המשך עם שלבי ההידול הבאים על ידי הכנת מדיום ההתברמות הדרוש והוספתו לתאים בימים המתאימים של ההתברנות בערך באותה שעה ביום. במחקר זה, אוכלוסיות מועשרות של בני ניצני כבד ותאים דמויי hepatocyte לאחר מכן נוצרים hPSCs.
ביום השני של ההבחנה, תאי פס פרימיטיביים הבדילו ליום שני תאי אנדודרמה מוחלטים. הרוב המכריע של תאים אלה מבטאים SOX17 ו FOXA2. ביום השלישי של ההבחנה, תאי האנדודרמה הבדילו לאוהי המצומדים המופיעים בצורת מצולע.
מאוחר יותר, ביום השישי, בני ה-foregut הבדילו לאבי ניצני הכבד. אלה ניצן הכבד progenitors להביע AFP, TPX3, ו HNF4alpha. על פני שלושה קווי hPSC, שיטה זו מייצרת יום שישה AFP חיובית בכבד progenitors ביעילות של כ 89%לבסוף, לאחר 18 ימים של התברות בכבד מ hPSCs, תאים דמויי hepatocyte חיובי אלבומין מופיעים.
מבחינה מורפולוגית, תאים אלה מופיעים אפיתל, ויוצרים גבולות בהירים המזכירים canaliculi מרה. בשלב זה, הציטופלסמה של היום 18 hepatocytes נגזר hPSC נראה כהה יותר מאשר הגרעין. כאשר זורעים תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים להתבולל, חובה לזרוע אותם בצפיפות הנכונה וגם להפיץ אותם על פני באר על ידי טלטול הצלחת.
היכולת לייצר hepatocytes אנושי במבחנה היא טכנולוגיה המאפשרת שיאפשר למדענים לחקור מנגנונים שבבסיס התפתחות הכבד. שיטה זו מייצרת מספר רב של hepatocytes אנושי במבחנה אשר יכול לשמש כדי לחקור את תפקוד הכבד ומחלות ובסופו של דבר לאפשר טיפולים חדשים לאי ספיקת כבד.
