פתוגנים מיקרוביאליים המשכפלים תאית חייבים בסופו של דבר לצאת מהתא הנגוע. אשר, בהשוואה להיבטים אחרים של אינטראקציות פתוגן המארח הוא understudied יחסית. כאן, אנו מתארים טכניקות לניתוח שפעת פתוגן.
אנו מראים כיצד ניתן להשתמש ב- assays פשוט יחסית כדי להעריך יעילות efflux או לאפיין פתוגנים שלאחר efflux הטכניקות הכלליות המתוארות כאן ישימות באופן נרחב למרות מודלים ספציפיים תא מארח פתוגן עשויים להיות שונים קינטיקה, המינונים ואולי לקרוא החוצה. כמו בהקמת כל מערכת ניסיונית, חיוני שיקבעו בקרות ברורות שיבטיחו שתהליכים ביולוגיים אמיתיים ינצפיו בדגימות ניסיוניות או בקובות. הפגנת ההליך תהיה פטריה גייל, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל בניסוי הזיהום, השתמשו ב-pipette כדי להוסיף 20 מיקרוליטרים של Lm inoculum שהוכן טרי ל הבאר, כאשר המנה מוטה מעט וקץ הפיפטי ממוקם בקפידה במדיה המוזלת. הימנע מנגיעה בקירות של באר עם קצה פיפטה. בעדינות pipette את התוכן של כל באר כדי להבטיח ערבוב מלא.
אין לנער או להטות באופן משמעותי את הצלחת כדי למנוע הפצת LM על קירות הבירה. להחזיר את צלחת תרבות התא ל 37 מעלות צלזיוס, חמישה אחוזים פחמן דו חמצני אינקובטור. השתמש במדיה מותנה מתאים לא מודבקים כמו diluent להכין 10 מיקרוגרם לכל פתרון ג'נטמיצין מיליליטר.
ב 30 דקות לאחר ההדבקה, בזהירות להוסיף 30 microliters של פתרון ג'נטמיצין לתוך המנה כדי להגיע לריכוז סופי של שתי נקודות חמש מיקרוגרם למיליליטר. בעדינות pipette את התוכן של הבאר לערבב ולהחזיר את צלחת תרבות התא לאנקובטור. כדי לקצור, מעט להטות את המנה בזהירות להשתמש פיפטה כדי להסיר את המדיה כולה מן הבאר.
הוסף נקודה-חמישה מיליליטר של מים מזוקקים וסטריליים ל באר. לאחר 30 שניות, להעביר את המים וכתוצאה מכך lysate לצינור microcentrifuge נקודה אחת חמש מיליליטר ומערבולת במרץ במשך 10 שניות. הוסיפו 4-5 מיקרוליטרים ו-50 מיקרוליטרים של המים ליאזט ל-450 מיקרוליטרים של מים מזוקקים וסטריליים כדי להכין את הדילול פי עשרה ומאה.
מערבולת בקצרה כדי להבטיח ערבוב יסודי. הוסיפו 50 מיקרוליטרים של הדגימות המדוללים והמדוללים פי מאה המקוריים על צלחות אגר מרק ליסוגני, והתפשטו בעזרת מפזר צלחות. כדי להגיד על LM המתעוררים, לחלץ 10 microliters של מדיה כיסוי מן המנה ולחלק אותו לשני aliquots חמישה מיקרוליטר צינורות מיקרו צנטריפוגה.
הוסף חמישה מיקרוליטרים של DMEM / FCS לאליקוט אחד והוסף חמישה מיקרוליטרים של DMEM / FCS המכילים חמישה מיקרוליטרים למיליליטר ג'נטמיצין לאליקוט השני כבקרה. חכה חמש דקות בטמפרטורת החדר. הוסיפו 90 מיקרוליטרים של מים סטריליים מזוקקים לכל אליטוט ומערבולת את השניים במרץ למשך 10 שניות.
לאחר מכן להוסיף 50 microliters של המדגם על צלחות אגר LB ולהפיץ באמצעות מפזר צלחת. לאחסן את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס אינקובטור במשך יומיים לפני ספירת מושבות Lm. באמצעות מונה תאים אוטומטי, התאם את התאים המוכנים, הגולמיים של 2-6-4 נקודות-7 לריכוז של פי 10 לתא השישי למיליליטר.
הוסף מיליליטר אחד של המדגם ל בארות של צלחת תרבות רקמה שש בארות. להדביק את התאים עם inoculum Lm מוכן, המתאים ריבוי של זיהום של 50. בנקודה אחת וחמש שעות לאחר ההדבקה, בצינור מיקרוצנטריפוגה של נקודה אחת וחמישה מיליליטר מלא ב-500 מיקרוליטרים של ארבעה אחוזי PFA, לאסוף מדיה מהסט הראשון של בארות ולה מניח את הצינור על קרח.
כדי לאסוף Lm תאי, להוסיף מיליליטר אחד של מים מזוקקים, סטריליים לכל באר. לאחר 60 שניות, להעביר את המים וכתוצאה מכך lysate לצינור מיקרוצנטריפוגה נקודה אחת וחמישה מיליליטר עם 500 microliters של ארבעה אחוזים PFA. מערבולת הצינור במרץ במשך 10 שניות ולה מניחים אותו על קרח.
עבור בארות שנותרו, להסיר מדיה ולהחליף עם מיליליטר אחד של DMEM / FCS עם חמישה מיקרוגרם למיליליטר ג'נטמיצין להרוג Lm.Lm.מיד להחזיר את המנה לאנקובטור. לאחר 30 דקות, להסיר מדיה ולהחליף עם DMEM / FCS ללא ג'נטמיצין. אחרי עוד שעתיים וארבע שעות, אוספים את התקשורת ב"ליזטס" בפעם השנייה והשלישית לתוך הצינורות ומ מניחים אותם על קרח כדי לצנן.
צינורות צנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G במשך שבע דקות. באמצעות פיפטה, להסיר על טבעי מבלי להפריע גלולה. הוסף קוקטייל מכתים המכיל 50 microliters של ארבעה אחוזים PFA ו 15 microliters של פאלודין לתוך הצינור ומערבבים להשעות כל גלולה.
צינורות דגירה בחושך בארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחר הדגירה, הוסף מיליליטר אחד של מאגר FACS לכל צינור ופיגט למעלה ולמטה כדי לערבב. צינורות ספין בצנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G במשך שבע דקות.
הסר על-טבעי מבלי להפריע לכדור. לשימוש מיידי, השהה כל גלולה ב- 400 מיקרוליטרים של מאגר FAX. אם מאחסנים לניתוח מאוחר יותר, הוסיפו 200 מיקרוליטרים של מאגר FAX ו-200 מיקרוליטרים של ארבעה אחוזי PFA לצינור וערבבו כדי להשעות.
באמצעות תנאי הזיהום בטיפול הקצר עם ג'נטמיצין אנטיביוטי לחסל Lm לא הפנימה, אפס נקודה אחת-1-5 אחוז של Lm מסוג פראי הוא התאושש לאחר נקודה אחת וחמש שעות של דגירה במשותף עם מקרופאגים מתורבתים. בה דגירה שותף לאחר מכן, חלה עלייה פי ארבעה ושבע נקודות וחמש בהתאוששות של Lm קיימא, אשר מייצגים באופן בלעדי התפשטות תאית. פרופיל דומה נצפתה עבור זן Lm בעל prfA היפר-ויראלי במהלך ההדבקה הראשונית, אך לא בין שלושה לשישה HPI.
כאשר prfA נמחק מזן Lm, יש ירידה לאחר מכן בהתאוששות של הזן לאחר דגירה שותף ממושך. כאשר ג'נטמיצין מוסר מן בארות בשש HPI, Lm חוץ תאית ניתן לזהות שעה מאוחר יותר עבור שני סוג פראי וזנים prfA hypervirulent, אבל לא עבור המתח עם prfA נמחק. כיסוי מדיה הן מקרופאגים נגועים והן נגועים הכיל חומר חלקיקי מפוזר באור, בגודל חיידק.
עם זאת, רק למדיה ממאקרופגים נגועים היו אותות חיוביים של GFP בתוך הגודל. עלייה תלוית זמן במראה של Lm חיובי פאלואידין נצפתה עם מקרופאגים נגועים. כאשר ציפוי את מקרופאגים בצלחת תרבות רקמות 48 היטב, להשאיר כמה בארות ללא תאים.
בארות שליטה אלה ללא תאים מטופלות אז בדיוק כמו בארות המכילות תאים, במונחים של תוספת של פתוגן, אנטיביוטיקה, וכו 'כדי להבטיח כי אותות ניסיוניים תלויים בנוכחות של תאים מארחים. בדומה לניסויים המוצגים בנתונים 1 ו-3, ניתן לבדוק גורמים פתוגן או מארח או מולקולות קטנות באשר להשפעתם על שפעת תאית פתוגנית.
