אנו מודים לד&quot;ר קרייג ורוי ד&quot;ר דריו מחליקים על מתן תבנית לזיהומים סלולריים protozoan. אנו מודים לד&quot;ר Jagdeep Obhrai, ד&quot;ר ג&#39;ורג&#39;יאנה פורדי, ד&quot;ר פרד הפרון וטוד יזנר לציוד וריאגנטים; ד&quot;ר הלול Cambronne לסקירה ביקורתית של כתב היד. cytometry הזרימה בוצע במתקן OHSU תזרים Cytometry המשותף המשאבים. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק מהקרן למחקר הרפואית של אורגון ומענק NIH R21 AI088275 (EDC).

1. הכנת תרבויות הלגיונלה pneumophila לזיהומים בשלב קרקע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך כל L. זני pneumophila משמשים assay עם pAM239 פלסמיד, קידוד איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) מושרים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) 28. רצף של זני חיידקים על ברזל וציסטאין תוספת N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic חומצה (ACES) נאגר אגר תמצית שמרי פחם (CYEA) המכיל 6.25 מיקרוגרם / המ&quot;ל chloramphenicol (CM) (לתחזוקת פלסמיד) ודגירה במשך 72 שעות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההעברה בוצע בידוד של זן החיידקים לתוך ACES תוספת נאגר מרק תמצית שמרים (כן) עם 6.25 מיקרוגרם / המ&quot;ל CM וIPTG 1 mM ולטפח לשלב נייח (O / N) בהקפה ייקרה ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשר ביטוי של GFP בתרבויות במבחנה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. העברת 10 μl של תרבות על גבי זכוכית מתחת לכיסויתלוש ותמונה באמצעות אובייקטיבי 60x עם עירור GFP / קוביית פליטה (AMG EVOS fl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל aliquot μl 100 של כל התרבות במבחנה ל1:10 באמצעות H 2 O. סטרילי לעשות שימוש 100 μl כן תקשורת ריקה עם IPTG 1 mM ו6.25 מיקרוגרם / מיליליטר סנטימטר ומים. קח OD600 מדידות של הדילולים באמצעות ספקטרופוטומטר (Bio-Rad החכם Spec פלוס). לחשב את הנפח דרוש כדי להדביק גם במשרד פנים = 20 לכל התרבות במבחנה: V = [(האמבה seeded) x משרד פנים] / [OD 600 x (גורם דילול) x (קבוע)] = [(1 X 10 6 ) X (20)] / [OD 600 x (10) x (1 x 10 6)] = 2/OD 600. ריכוז החיידקים נקבע כOD 600 = 1.0 = 1 x 10 9 CFU / מ&quot;ל. </li></ol> 2. זיהום שלב יחול שימוש Acanthamoeba castellanii <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור ולטפח את האמבות במדיום PYG ATCC 712 ב175 סנטימטר 2 צלוחיות בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף תקשורת במבוי סתום אמבותtures 24 שעות לפני תחילת התרבויות הנוזליות החיידקים. באותו היום תרבויות חיידקי נוזלים התחילו, לאסוף ולספור תאים במיקרוסקופ אור באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל את האמבות עם תקשורת הטריה לריכוז סופי של 1 10 6 תאים / מ&quot;ל x. זרעי צלחות 12-גם תא תרבות עם 1 aliquots המ&quot;ל של האמבות באמצעות pipettor חוזר ולדגור על RT O / נ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לשטוף את הבארות של צלחות תא התרבות גם 12-3x עם 1 המ&quot;ל סטרילי PBS באמצעות פיפטה 10 מ&quot;ל סרולוגית וסיוע פיפטה ידנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השאיפה של PBS, להוסיף 1ml של זיהום תקשורת (712 ATCC תקשורת PYG מינוס גלוקוז, peptone ותמצית שמרים) עם IPTG 1 מ&quot;מ ו6.25 סנטימטר מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​לכל באר. דגירת הצלחות בRT לשעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק בארות במשרד פנים = 20. צנטריפוגה את הצלחת ב 400 XG למשך 5 דקות (אפנדורף 5810R) ותצוף באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. להעביר לצלחת 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 חממה על 18 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשר את הזיהומים באמצעות הדמית תא חייה במיקרוסקופ פלואורסצנטי לפני לארח תמוגה תא וקציר של חיידקים. </li></ol> 3. זריעת THP-1 תאים לזיהום שלב תא יעד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (בגין 24 שעתי התהליך הזה לפני הקמת תרבויות חיידקים נוזליות). לטפח THP-1 תאים ב75 סנטימטר 2 צלוחיות תרבות הקרובה confluency ב1640 תקשורת RPMI עם סרום 10% חום מומת עוברי שור (FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים באמצעות השעית hemocytometer, לדלל את THP-1 תאי שנת 1640 תקשורת RPMI עם 10% FBS ו 100 ng / ml phorbol-12-myristate-13-תצטט (PMA) לריכוז של 1 10 x 6 תאים / מ&quot;ל , וצלחת ב1 aliquots מ&quot;ל על צלחות תרביות תאים 12-כן. דגירת הצלחות עבור 48 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li></ol> 4. עיבוד של חיידקים לזיהום שלב תא יעד לאחר זיהום שלב Priming <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התקשורת מהאמבות הדרוכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lysemoebae באמצעות 500 μl של הקרח הקר, Ultra-המסונן (UF) H 2 O סטרילית ולדגור על RT למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברכת lysates לפי הסוג להתאמץ ולקחת מדידת ננומטר E 512 עבור כל אחד מlysates אסף באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטי (המולקולרי ההתקנים Spectramax ג&#39;מיני EM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב 600 מדידה OD לlysates אסף: calcOD 600 = 0.0008 (E 512 - רקע lysate) + 0.0019. הנוסחא נקבעה בעבר על ידי שרטוט השוואה ישירה של שני OD 600 ושל 512 ננומטר מדידות E של דילולים של L. pneumophila GFP פראי מסוג הבעה משלב נייח בתרבות חוץ גופייה (איור 1 *). את lysates של אמבה אינה נגועה, בכפוף לאותם תנאים ניסיוניים כמו אמבה הנגועה, משמש כריק וספק ערך תיקון (למשל רקע lysate), אשר התאגד למשוואה. T הנפח הדרושo להדביק גם במשרד פנים = 20 מחושב לכל ברכת lysate: V = [(THP-1 seeded) x משרד פנים] / [calcOD 600 x (קבוע)] = [(1 X 10 6) x (20)] / [CalcOD 600 x (1 x 10 6)] = 20 / calcOD 600. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את THP-1 תאי 3x עם PBS ולהוסיף 1 המ&quot;ל RPMI טרי 1640 (10% FBS) לכל באר. THP-1 תאי דגירה במשך השעה 1 ב 37 ° C, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק את תאי THP-1 במשרד פנים המחושבים באמצעות lysates אסף. אפשר סט של בארות להישאר נגוע, ושמש כשליטה שלילית לניתוח cytometric זרימה. העיבוד לבמה תחול אמור להסתיים בפחות מ 30 דקות. את lysates נשמרים על קרח כדי להגביל כל שינויים בביטוי גני חיידקים לפני הזיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת, לצוף להעלות את הטמפרטורה, ולדגור כמו בשלב יחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שעה אחת לאחר פגיעה, להסיר את המדיה על ידי שאיפה ולשטוף בארות 3x עם PBS להסיר חיידקים תאיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל fresh RPMI 1640 (10% FBS) לבארות ולהחזיר את הצלחת לאינקובטור. הזמן מייד לאחר החלפת מדיה משמש כזמן אפס (ט 0). דגירת THP-1 התאים עבור 14-16 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li></ol> 5. ניתוח ניסויי הדמית תא חייה 5.1 תמונת הבארות הנגועות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (AMG EVOS fl) ב10X או 20X הגדלה (תרשימי 1A-D). את התמונות ניתן להשוות בין איכותי או כמותית לקביעת רמות הזיהום הוא בשלב האתחול וזיהומים בשלב תא המטרה. cytometry זרימה 5.2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פסגות הפליטה של ​​זיהומים שונים ניתן להשוות על ידי cytometry זרימה (FACS BD Calibur). Trypsinize את THP-1 התאים הנגועים ולשטוף בעדינות אותם מהבארות ידי הערבוב ב PBS עם פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברכת התאים לפי סוג הזן לתוך 15 מ&quot;ל פלקון צינורות וגלולים ב 1800 XG ל2דקות בצנטריפוגה בראש הטבלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את הכדורים במ&quot;ל PBS 1 ותעביר ל1.5 צינורות microcentrifuge מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את המתלים ב1800 x גרם (אפנדורף 5424) ומחדש להשעות את הכדורים במ&quot;ל PBS 1. אם כתוצאה מכך הם ההשעיות עכורות מאוד (OD 600 ≥ 1.0) הם חייבים להיות מדוללים ב PBS נוסף (1:03) כדי למנוע סתימה של הקווים בcytometer הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש PBS סטרילי המסונן לאיזון של cytometer הזרימה ועל צעדים לרחוץ בין זריקות לדוגמה. עלילה מתפזרת קדימה / צד של תאי המטרה נגועים לפני ההזרקה של דגימות זיהום תא המטרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 20,000 אירועים כלל לכל מצב באמצעות עירור 488 ננומטר ליזר וערוץ FL1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוכלוסיות תאים שלאחר לכידת שער להוציא תאים נגועים ואינטנסיביות עלילת פלואורסצנטי ביסטוגרמה (FlowJo) (האיור 1E). </li></ol> 5.3 ציפוי CFU <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון את יעילות oזיהום F ע&quot;י ציפוי CFU של התאים נקצרו עבור cytometry זרימה. הכן דילולים סידוריים של הדגימות בH 2 O Ultra-מסונן ב -10 -1, 10 -2, ו10 -3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 μl הצלחת של כל דילול על 1/3 מצלחת CYEA עם 6.25 מיקרוגרם / המ&quot;ל סי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את המושבות באמצעות קיסם ודלפק תא. </li></ol>

<ol>
	<li>Mahan, M. J., Slauch, J. M., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+bacterial+virulence+genes+that+are+specifically+induced+in+host+tissues.">Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissues.</a> Science. 259, 686-688 (1993).</li><li>Mahan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-based+selection+for+bacterial+genes+that+are+specifically+induced+during+infection+of+a+host.">Antibiotic-based selection for bacterial genes that are specifically induced during infection of a host.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 669-673 (1995).</li><li>Rankin, S., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Legionella+pneumophila+promoters+regulated+by+the+macrophage+intracellular+environment.">Identification of Legionella pneumophila promoters regulated by the macrophage intracellular environment.</a> Infect. Agents Dis. 2, 269-271 (1993).</li><li>Rankin, S., Li, Z., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-induced+genes+of+Legionella+pneumophila:+protection+from+reactive+intermediates+and+solute+imbalance+during+intracellular+growth.">Macrophage-induced genes of Legionella pneumophila: protection from reactive intermediates and solute imbalance during intracellular growth.</a> Infect. Immun. 70, 3637-3648 (2002).</li><li>Fields, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+ecology+of+legionellae.">The molecular ecology of legionellae.</a> Trends Microbiol. 4, 286-290 (1996).</li><li>Cirillo, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+growth+in+Acanthamoeba+castellanii+affects+monocyte+entry+mechanisms+and+enhances+virulence+of+Legionella+pneumophila.">Intracellular growth in Acanthamoeba castellanii affects monocyte entry mechanisms and enhances virulence of Legionella pneumophila.</a> Infect. Immun. 67, 4427-4434 (1999).</li><li>Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Legionella+pneumophila+in+Acanthamoeba+castellanii+enhances+invasion.">Growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii enhances invasion.</a> Infect. Immun. 62, 3254-3261 (1994).</li><li>Faucher, S. P., Mueller, C. A., Shuman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+Transcriptome+during+Intracellular+Multiplication+in+Human+Macrophages.">Legionella pneumophila Transcriptome during Intracellular Multiplication in Human Macrophages.</a> Front Microbiol. 2, 60 (2011).</li><li>Kilvington, S., Price, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+Legionella+pneumophila+within+cysts+of+Acanthamoeba+polyphaga+following+chlorine+exposure.">Survival of Legionella pneumophila within cysts of Acanthamoeba polyphaga following chlorine exposure.</a> J. Appl. Bacteriol. 68, 519-525 (1990).</li><li>King, C. H., Shotts, E. B., Wooley, R. E., Porter, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+coliforms+and+bacterial+pathogens+within+protozoa+during+chlorination.">Survival of coliforms and bacterial pathogens within protozoa during chlorination.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 3023-3033 (1988).</li><li>Horwitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+novel+phagosome+by+the+Legionnaires'+disease+bacterium+(Legionella+pneumophila)+in+human+monocytes.">Formation of a novel phagosome by the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) in human monocytes.</a> J. Exp. Med. 158, 1319-1331 (1983).</li><li>Horwitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+the+Legionnaires'+disease+bacterium+(Legionella+pneumophila)+occurs+by+a+novel+mechanism:+engulfment+within+a+pseudopod+coil.">Phagocytosis of the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) occurs by a novel mechanism: engulfment within a pseudopod coil.</a> Cell. 36, 27-33 (1984).</li><li>Horwitz, M. A., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionnaires'+disease+bacterium+(Legionella+pneumophila)+multiples+intracellularly+in+human+monocytes.">Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) multiples intracellularly in human monocytes.</a> J. Clin. Invest. 66, 441-450 (1980).</li><li>Burstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+identification+of+Legionella+pneumophila+effectors+using+a+machine+learning+approach.">Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach.</a> PLoS Pathog. 5, e1000508 (2009).</li><li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+protein+substrates+of+the+Dot/Icm+type+IV+transporter+of+Legionella+pneumophila.">Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila.</a> PLoS One. 6, e17638 .</li><li>Nagai, H., Kubori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IVB+Secretion+Systems+of+Legionella+and+Other+Gram-Negative+Bacteria.">Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria.</a> Front Microbiol. 2, 136 (2011).</li><li>Hubber, A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+host+cell+function+by+Legionella+pneumophila+type+IV+effectors.">Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).</li><li>Shin, S., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell+processes+that+influence+the+intracellular+survival+of+Legionella+pneumophila.">Host cell processes that influence the intracellular survival of Legionella pneumophila.</a> Cell Microbiol. 10, 1209-1220 (2008).</li><li>Berger, K. H., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+defects+in+intracellular+growth+complemented+by+a+single+genetic+locus+in+Legionella+pneumophila.">Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila.</a> Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).</li><li>Marra, A., Blander, S. J., Horwitz, M. A., Shuman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Legionella+pneumophila+locus+required+for+intracellular+multiplication+in+human+macrophages.">Identification of a Legionella pneumophila locus required for intracellular multiplication in human macrophages.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 9607-9611 (1992).</li><li>Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell+killing+and+bacterial+conjugation+require+overlapping+sets+of+genes+within+a+22-kb+region+of+the+Legionella+pneumophila+genome.">Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).</li><li>Segal, G., Shuman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+new+region+required+for+macrophage+killing+by+Legionella+pneumophila.">Characterization of a new region required for macrophage killing by Legionella pneumophila.</a> Infect Immun. 65, 5057-5066 (1997).</li><li>Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugative+transfer+by+the+virulence+system+of+Legionella+pneumophila.">Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila.</a> Science. 279, 873-876 (1998).</li><li>Haghjoo, E., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+transcriptional+regulator+that+controls+intracellular+gene+expression+in+Salmonella+Typhi.">Identification of a transcriptional regulator that controls intracellular gene expression in Salmonella Typhi.</a> Mol. Microbiol. 64, 1549-1561 (2007).</li><li>Molofsky, A. B., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiate+to+thrive:+lessons+from+the+Legionella+pneumophila+life+cycle.">Differentiate to thrive: lessons from the Legionella pneumophila life cycle.</a> Mol. Microbiol. 53, 29-40 (2004).</li><li>Hammer, B. K., Tateda, E. S., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-component+regulator+induces+the+transmission+phenotype+of+stationary-phase+Legionella+pneumophila.">A two-component regulator induces the transmission phenotype of stationary-phase Legionella pneumophila.</a> Mol. Microbiol. 44, 107-118 (2002).</li><li>Ninio, S., Zuckman-Cholon, D. M., Cambronne, E. D., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Legionella+IcmS-IcmW+protein+complex+is+important+for+Dot/Icm-mediated+protein+translocation.">The Legionella IcmS-IcmW protein complex is important for Dot/Icm-mediated protein translocation.</a> Mol. Microbiol. 55, 912-926 (2005).</li><li>Neild, A. L., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+reveal+dendritic+cell+functions+that+facilitate+selection+of+antigens+for+MHC+class+II+presentation.">Legionella reveal dendritic cell functions that facilitate selection of antigens for MHC class II presentation.</a> Immunity. 18, 813-823 (2003).</li><li>Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amoebae+as+training+grounds+for+intracellular+bacterial+pathogens.">Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).</li><li>Huws, S. A., Smith, A. W., Enright, M. C., Wood, P. J., Brown, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amoebae+promote+persistence+of+epidemic+strains+of+MRSA.">Amoebae promote persistence of epidemic strains of MRSA.</a> Environ. Microbiol. 8, 1130-1133 (2006).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

ביטוי גני חיידקי נתונה לפיקוח הדוק באמצעות שילוב של התקדמות ותגובה לאותות בmicroenvironment סביב מחזור חיים. פתוגנים Vacuolar כגון L. pneumophila להגיב לשפע של רמזים מארחים תא המופקים כאשר ממודר בphagosome. כתוצאה קולקטיבית של תשישות תזונתית בתא הפונדקאי, החיידק מפצה על ידי הבעת גורמ...

חיידקים פתוגנים רבה יש להתאים את האסטרטגיות כלליות לניצול תאי מארח להישרדות ושכפולה בתא תאי. במקרים רבים, מנגנונים פתוגניים דומים בין תאים מטזואניים protozoan ו. עם זאת, שני microenvironments האלה שונים מאוד ויכול לגרום לביטוי הפרש של 1-4 גורמים ארסיים. המחלה הליגיונרים חיידק הלגיונלה pneumophila קשור ubiquitously עם סביבות מים מתוקים 5 ברחבי העולם. חשוב לציין, L. pneumophila טפח בתאי protozoan לפני הזיהום של מונוציטים אדם להשיג יתרון פתוגניים, מה שמרמז כי פרופילי ביטוי גנים הגלובליים של חיידק יציאת תא protozoan הם שונים מזה של במבחנה טפחה האורגניזם 6-8. בטבע, אמבות מים מתוקים לספק גבולות עשירים ברכיבים מזינים להגברה מהירה של חיידק פולש. רכישה אנושית ל &#39; pneumophמנהל מקרקעי ישראל הוא לרוב מיוחס לשאיפה של טיפי מים מזוהמים המכילות את החיידק. סביר להניח כי חיידקים אלו טיפי נמל protozoan תאים נלווים; בו תאי protozoan הם עמידים יותר לשיטות טיפול במים קונבנציונליים 9,10. זיהום של תמורת מקרופגים מכתשיים ריאה באופן כמעט זהה למחזור החיים התאי של החיידק בתאי פונדקאי protozoan 11-13. כדי לשרוד ולהתרבות בתאים האיקריוטים, L. pneumophila משתמש במערכת מיוחדת סוג IVB הפרשה נקראת דוט / ICM כדי לספק כמעט 300 חלבונים &#39;מפעיל&#39; לcytosol של התא המארח 14-16. חלבונים אלה מפעיל קולקטיבי לתפקד לחתור תחת תהליכים תאיים על מנת ליצור תא מתירנית שכפול לחיידק 17,18. מחיקות בכל של 26 גנים המרכיבים את תוצאת טרנספורטר דוט / ICM בזנים פגומים לmult התאיiplication 19-23. מבחינה הסטורית, מחיקה של גני קידוד מפעיל בודדים כמעט והביאה לזנים מוחלשים לצמיחה תאית. תופעה זו יוחסה לכמה היפותזות כוללים פונקציה מיותרת ועותקים של paralogous effectors. החלק מהגורמים ארסיים באים לידי ביטוי רק בהקשר של צמיחת מארח תא הקשורים תאית 24. אנו רציונליזציה שאם מפעיל מסוים בא לידי ביטוי רק בהקשר של זיהום protozoan, אז התרומה של המפעיל, אינו יכולה להשתוות עם זן פראי סוג כאשר הן היו בתרבית במבחנה. L. pneumophila מעברים מreplicative לשלב מעביר כפי שהוא נכנס שלב נייח בתרבות 25. פנוטיפ מיתוג השלב מייצג את הדלדול התזונתי נתקל במהלך צמיחה תאית ומודגם באמצעות הרכבה של וטונים לתנועתיות 26. בגלל L. pneumophila הוא inva יותרsive וארסי כשנקצר מתאי protozoan, אנחנו בקשנו לפתח assay שייצג את המדינה הפתוגני של החיידק נאמן יותר כאשר הוא נתקל מקרופאגים המארחים. לצורך כך, פתח assay יחול protozoan תכליתי שיכול להכיל את כל מארח מתאים לשני (תא המטרה) זיהומי השלב הראשונים (תא יחול) ושניים. תהליך ההדבקה הוא צייתן באמצעות שימוש בחיידקים ביציבות להביע חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). המודל לזיהום protozoan Acanthamoeba castellanii כדלקמן המתודולוגיה בשימוש נרחב בתחום 27. לצעד הנפץ, L. זני pneumophila מעובדות במבחנה לשלב נייח בתקשורת הנוזלית לייצור חיידקים שכותרתו &quot;העברה ל&#39;(איור 1 א). חיידקים משמשים הבא כדי להדביק monolayers של A. castellanii עבור 18 שעות כדי להשיג שלב מאוחר של מחזור החיים התאי. וקואולות גדולה מכילהחיידקי ing ניתן דמיינו בנקודת זמן זו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1 א). תאי protozoan מכן lysed וחיידקים התאוששו מlysate נמדדים לפליטה ב512 ננומטר באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטי. פלואורסצנטי מתואם עם צפיפות אופטית לחישוב ריבוי-of-זיהום (משרד פנים) להדבקת תאי היעד (1 איור, * המתאם Curve). לאחר פלישה (ט 0) ו 18 שלאחר פלישה (ט 18) שעות, תאי יעד לכימות לקרינה, המייצגים חיידקים תוך תאיים. פלואורסצנטי ניתן לפקח על ידי מיקרוסקופ וcytometry זרימה, וספירת קיימא ניתן למדוד באמצעות ציפוי מושבה. Assay יחול תמיד מלווה בזיהומים עם ל &#39;פרא מסוג pneumophila ומתח פגום במערכת דוט / ICM הסוג הרביעית ההפרשה (Δ DotA) (איור 1 א). זה חשוב מספק בקרות פנימיות להשוואה ישירה בין פרא מסוגnd כל זנים מוטנטים isogenic המשמשים בתהליך ההדבקה. ההכללה של זן dota Δ לא האלים בשלב יחול קובעת סף לתצפית של פנוטיפים צמיחה נחלשו קשורים בזנים מוטנטים isogenic כי הם בתרבית במבחנה.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>chloramphenicol</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP904-100</td>
 <td>antibiotic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1755-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ACES</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9758-1KG</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATCC medium: 712 PYG</td>
 <td>ATCC</td>
 <td></td>
 <td>growth media for protozoans</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X PBS</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>SH30256FS</td>
 <td>phosphate buffered saline</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>activated charcoal</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>C272-212</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>yeast extract</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1422-500</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>peptone</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>211677</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>agar</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1423-2</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-cysteine, 99%+</td>
 <td>Acros organics</td>
 <td>173601000</td>
 <td>media supplement</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ferric nitrate nonahydrate</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>I110-100</td>
 <td>media supplement</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EVOS fl</td>
 <td>AMG</td>
 <td>EVOS fl</td>
 <td>fluorescence microscope</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Smart Spec Plus</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-2525</td>
 <td>spectrophotometer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5810 R centrifuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>22627023</td>
 <td>bench top centrifuge</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Repeater plus</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>22230201</td>
 <td>repeating pipette</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SpectraMax Gemini EM</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td></td>
 <td>microplate reader</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Softmax Pro 5.3</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>0200-310</td>
 <td>microplate reader software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5424 microfuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>22620401</td>
 <td>table top microcentrifuge</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fast-release pipette pump II</td>
 <td>Scienceware</td>
 <td>379111010</td>
 <td>pipette aid</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FACS Calibur</td>
 <td>BD Bioscience</td>
 <td></td>
 <td>flow cytometer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FlowJo 7.6.1</td>
 <td>FlowJo</td>
 <td>license</td>
 <td>flow cytometery software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tube</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352096</td>
 <td>polypropylene conical tube</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.6 ml microfuge tube</td>
 <td>Neptune</td>
 <td>3745.X</td>
 <td>microcentrifuge tubes</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

tractable mammalian cell infections with protozoan-primed bacteria

חיידקים פתוגנים תאי רבה משתמשים הפרוטוזואנים מים מתוקים כמאגר טבעי לשגשוג בסביבה. הלגיונלה pneumophila, הגורם לכך מדלקת הריאות הליגיונרים, זוכה ליתרון על פני בחיידקים פתוגניים בתרבית מבחנה כאשר נקטפו ראשון מתאי protozoan לפני הזיהום של מקרופאגים יונקים. הדבר מרמז כי גורמים ארסיים חשובים לא יכולים לבוא לידי הביטוי כראוי במבחנה. פתחנו מערכת צייתנית ליחולו L. pneumophila דרך מארח protozoan הטבעי Acanthamoeba castellanii לפני הזיהום של תאי יונקים. תרומתו של כל גורם ארסיות ניתן לבדוק על ידי השוואת צמיחה תאית של זן מוטציה לחיידקי סוג פראי לאחר שהכין מראש protozoan. GFP-להביע פראי סוג והמוטציה L. זני pneumophila משמשים להדביק monolayers protozoan בשלב אתחול ואפשרו להגיע לשלבים מאוחרים של גידול תאי. חיידקי פלורסנט אז נקצרים מן התאים הנגועים האלה ונירמול של ספקטרופוטומטריה לייצר מספרים דומים של חיידקים לזיהום לאחר למקרופאגים יונקים. לכימות, חיידקי חיים מנוטרים לאחר הדבקה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, cytometry זרימה, ועל ידי ציפוי מושבה. טכניקה זו מדגישה ומסתמכת על התרומה של ביטוי גני התא תלוי מארח על ידי חיקוי הסביבה שהיה נתקלה במסלול רכישה טבעית. גישה זו יכולה להיות שונה כדי להתאים לכל חיידק שמשתמש מארח מתווך כאמצעי להשגת יתרון פתוגניים.

תוצאה אופיינית לתהליך ההדבקה כל מתוארת באיור 1. לחיות micrographs קרינה סלולרית המתאר monolayers של A.castellanii נגוע בL. פראי מהסוג pneumophila בשלב יחול מוצג באיור 1 א. מידת הצלחה של הצעד יחולו תוביל לאוכלוסייה של כ 90% מתאי המארח המכילים וקואולות גדולה המא...

Watch this Scientific Journal Video about Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria at JoVE.com

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

טכניקה זו מספקת שיטה לקצור, לנרמל ולכמת צמיחה תאית של חיידקים פתוגנים כי הם מראש מעובדים בתאי פונדקאי protozoan טבעיים לפני הזיהומים של תאי יונקים. שיטה זו יכולה להיות שונה כדי להתאים מגוון רחב של תאי מארח לבמה יחול כמו גם סוגי תאי היעד.

זיהומים של תאי יונקים צייתנים עם חיידקי protozoan דרוך-

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

tractable-mammalian-cell-infections-with-protozoan-primed-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.4K Views.  Oregon Health & Science University. טכניקה זו מספקת שיטה לקצור, לנרמל ולכמת צמיחה תאית של חיידקים פתוגנים כי הם מראש מעובדים בתאי פונדקאי protozoan טבעיים לפני הזיהומים של תאי יונקים. שיטה זו יכולה להיות שונה כדי להתאים מגוון רחב של תאי מארח לבמה יחול כמו גם סוגי תאי היעד.

Video: Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

שימוש בלוציפראז לזיהומים חיידקיים תמונה ב עכברים

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

דור Multivirus ספציפיים תאים T כדי למנוע / לטפל זיהומים נגיפיים לאחר השתלת allogeneic תא גזע hematopoietic

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

הדמיה של multimodality 4D<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; זיהומים בעכברים

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols to address these questions include colony count assays, gentamicin protection assays, and electron microscopy. Colony count and gentamicin protection assays only assess the viability of the entire bacterial population and are unable to determine individual bacterial viability. Electron microscopy can be used to determine the viability of individual bacteria and provide information regarding their localization in host cells. However, bacteria often display a range of electron densities, making assessment of viability difficult. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells. These assays were developed originally to assess survival of Neisseria gonorrhoeae in primary human neutrophils, but should be applicable to any bacterium-host cell interaction. These protocols combine membrane-permeable fluorescent dyes (SYTO9 and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), which stain all bacteria, with membrane-impermeable fluorescent dyes (propidium iodide and SYTOX Green), which are only accessible to nonviable bacteria. Prior to eukaryotic cell permeabilization, an antibody or fluorescent reagent is added to identify extracellular bacteria. Thus these assays discriminate the viability of bacteria adherent to and inside eukaryotic cells. A protocol is also provided for using the viability dyes in combination with fluorescent antibodies to eukaryotic cell markers, in order to determine the subcellular localization of individual bacteria. The bacterial viability dyes discussed in this article are a sensitive complement and/or alternative to traditional microbiology techniques to evaluate the viability of individual bacteria and provide information regarding where bacteria survive in host cells.

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells.

שיטות מיקרוסקופית הקרינה לקביעת הכדאיות של חיידקים באיגוד עם תאי יונקים

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

gingivalis Porphyromonas כאורגניזם מודל להערכת אינטראקציה של חיידקים אנאירוביים עם תאי מארח

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

באמצעות מודלי דג זברה של נגיף שפעת A האדם למסך תרופות אנטי ולאפיין מארח תגובות תא חיסון

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their mucus-plugged bronchioles create a favorable habitat for microbial colonization. Various pathogens thrive in this environment interacting with each other and driving many of the symptoms associated with CF disease. Like any microbial community, the chemical conditions of their habitat have a significant impact on the community structure and dynamics. For example, different microorganisms thrive in differing levels of oxygen or other solute concentrations. This is also true in the CF lung, where oxygen concentrations are believed to drive community physiology and structure. The methods described here are designed to mimic the lung environment and grow pathogens in a manner more similar to that from which they cause disease. Manipulation of the chemical surroundings of these microbes is then used to study how the chemistry of lung infections governs its microbial ecology. The method, called the WinCF system, is based on artificial sputum medium and narrow capillary tubes meant to provide an oxygen gradient similar to that which exists in mucus-plugged bronchioles. Manipulating chemical conditions, such as the media pH of the sputum or antibiotics pressure, allows for visualization of the microbiological differences in those samples using colored indicators, watching for gas or biofilm production, or extracting and sequencing the nucleic acid contents of each sample.

The mucus plugged airways of cystic fibrosis (CF) patients are an ideal environment for microbial pathogens to thrive. The manuscript describes a novel method for studying the CF lung microbiome in an environment that mimics where they cause disease and how alterations of chemical conditions can drive microbial dynamics.

מודל ה- WinCF - מיקרוסקוס הזול והבלתי נסבל של ברונכייל מחובר ריר לחקר המיקרוביולוגיה של זיהומי ריאות

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

הדמיה קונאפוקלית של זוגיות גדילי RNA ודפוס זיהוי רצפטורים להדבקת וירוס RNA שלילי-סנס

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...