Los patógenos microbianos que se replican intracelularmente deben salir eventualmente de la célula infectada. Que, en comparación con otros aspectos de las interacciones de patógenos del huésped es relativamente poco estudiado. Aquí, describimos técnicas para analizar el eflujo de patógenos.
Mostramos cómo se pueden utilizar ensayos relativamente sencillas para evaluar la eficiencia del eflujo o caracterizar patógenos post-eflujo Las técnicas generales descritas aquí son ampliamente aplicables, aunque los modelos específicos de células host de patógenos pueden diferir en cinética, dosis y posiblemente lecturas. Al igual que en la creación de cualquier sistema experimental, es esencial que se establezcan controles claros que garanticen que se observen procesos biológicos genuinos en muestras o cohortes experimentales. Demostrando el procedimiento estará Petoria Gayle, una estudiante de posgrado de mi laboratorio.
Para comenzar con el experimento de infección, utilice una pipeta para añadir 20 microlitros del inóculo Lm recién preparado a los pozos, con el plato ligeramente inclinado y la punta de la pipeta cuidadosamente colocada en el medio superponiendo. Evite tocar las paredes del pozo con la punta de la pipeta. Pipetear suavemente el contenido de cada pozo para asegurar una mezcla completa.
No agite ni incline significativamente la placa para evitar la propagación de LM sobre las paredes del pozo. Devuelva el plato de cultivo celular a la incubadora de dióxido de carbono de 37 grados Celsius, cinco por ciento. Utilice medios condicionados de células no infectadas como diluyente para preparar una solución de gentamicina de 10 microgramos por mililitro.
A los 30 minutos después de la infección, agregue cuidadosamente 30 microlitros de la solución de gentamicina en el plato para alcanzar una concentración final de dos puntos a cinco microgramos por mililitro. Pipetear suavemente el contenido del pozo para mezclar y devolver el plato de cultivo celular a la incubadora. Para cosechar, incline ligeramente el plato y utilice cuidadosamente una pipeta para retirar todo el medio del pozo.
Agregue el punto cinco mililitros de agua destilada y estéril al pozo. Después de 30 segundos, transfiera el agua resultante al lito de agua resultante a un tubo de microcentrífuga de un punto y cinco mililitros y vórtice vigorosamente durante 10 segundos. Agregue microlitros de cuatro puntos a cinco y 50 microlitros del suave de agua a 450 microlitros de agua destilada y estéril para preparar las diluciones de diez y cien veces.
Brevemente vórtice para asegurar una mezcla completa. Añadir 50 microlitros de las muestras originales rídlicas diluidas y cien veces diluidas en placas de agar de caldo de suave contenido, y esparcir con un esparcidor de placas. Para ensayar el LM emergente, extraiga 10 microlitros de los medios superpuestos del plato y divídelo en dos alícuotas de cinco microlitros y micro centrífugas.
Agregue cinco microlitros de DMEM/FCS a una alícuota y agregue cinco microlitros de DMEM/FCS que contengan cinco microlitros por mililitro gentamicina a la segunda alícuota como control. Espere cinco minutos a temperatura ambiente. Añadir 90 microlitros de agua estéril destilada a cada alícuota y vórtice los dos vigorosamente durante 10 segundos.
A continuación, añada 50 microlitros de la muestra en placas de agar LB y extienda con un esparcidor de placas. Almacene las placas en una incubadora de 37 grados centígrados durante dos días antes de enumerar las colonias lm. Usando un contador de células automatizado, ajuste las células preparadas, crudas de dos,seis,cuatro puntos y siete a la concentración de una por 10 a la sexta célula por mililitro.
Agregue un mililitro de la muestra a los pozos de una placa de cultivo de tejido de seis pozos. Infectar las células con un inóculo Lm preparado, correspondiente a una multiplicidad de infección de 50. En un punto a cinco horas después de la infección, en un tubo de microcentrífuga de un punto a cinco mililitros lleno de 500 microlitros de cuatro por ciento de PFA, recoger los medios del primer conjunto de pozos y colocar el tubo en hielo.
Para recoger Lm intracelular, agregue un mililitro de agua destilada y estéril a cada pozo. Después de 60 segundos, transfiera el élizado de agua resultante a un tubo de microcentrífuga de un punto y cinco mililitros con 500 microlitros de PFA de cuatro por ciento. Vórtice el tubo vigorosamente durante 10 segundos y colóquelo sobre hielo.
Para los pozos restantes, retire los medios y sustitúyalos con un mililitro de DMEM/FCS con cinco microgramos por mililitro de gentamicina para matar el lm extracelular.Devuelva rápidamente el plato a la incubadora. Después de 30 minutos, retire los medios y sustitúyalo por DMEM/FCS sin gentamicina. Después de otras dos y cuatro horas, recoger los medios de comunicación en lysates por segunda y tercera vez puntos en los tubos y colocarlos en hielo para enfriar.
Tubos centrífugos a 10.000 veces G durante siete minutos. Con una pipeta, retire el sobrenadante sin alterar el pellet. Añadir el cóctel de tinción que contiene 50 microlitros de cuatro por ciento de PFA y 15 microlitros de faloide en el tubo y mezclar para suspender cada pellet.
Incubar tubos en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Después de la incubación, agregue un mililitro de tampón FACS a cada tubo y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Gire los tubos en la centrífuga a 10.000 veces G durante siete minutos.
Retire el sobrenadante sin alterar el pellet. Para uso inmediato, suspenda cada pellet en 400 microlitros de tampón FAX. Si se almacenan para su posterior análisis, agregue 200 microlitros de tampón FAX y 200 microlitros de cuatro por ciento de PFA en el tubo y mezcle para suspender.
Utilizando las condiciones de infección en el breve tratamiento con el antibiótico gentamicina para eliminar lm no internalizado, cero punto uno-cinco por ciento del tipo silvestre Lm se recupera después de un punto-cinco horas de coincimenculación con macrófagos cultivados. En la posterior incubación, hubo un aumento de cuatro y siete puntos por cinco en la recuperación de Lm viable, que representan exclusivamente la proliferación intracelular. Se observó un perfil comparable para la cepa Lm que poseía una prfA hipervirulenta durante la infección inicial, pero no entre tres y seis HPI.
Cuando el prfA se eliminó de la cepa Lm, hay una reducción posterior en la recuperación de la cepa después de una co-incubación prolongada. Cuando la gentamicina se retira de los pozos a seis HPI, lm extracelular se puede detectar una hora más tarde para cepas de prfA de tipo salvaje e hipervirulante, pero no para la cepa con prfA eliminado. Los medios que se superponen tanto los macrófagos no infectados como los infectados contenían partículas de dispersión de luz y de forma de bacteria.
Sin embargo, sólo los medios de los macrófagos infectados poseían señales positivas de GFP dentro del tamaño de la gama. Se observó un aumento dependiente del tiempo en la apariencia de falhalloidina positiva Lm con macrófagos infectados. Al enchapar los macrófagos en el plato de cultivo de tejido de 48 pozos, deje algunos pozos sin células.
Estos pozos de control sin células se tratan exactamente igual que los pozos que contienen células, en términos de la adición del patógeno, antibióticos, etc. para garantizar que las señales experimentales dependen de la presencia de células huésped. Similar a los experimentos mostrados en las figuras uno y tres, los factores patógenos o host y o moléculas pequeñas pueden ser probados en cuanto a su impacto en el eflujo celular patógeno.
