Gli agenti patogeni microbici che si replicano intracellularmente devono eventualmente uscire dalla cellula infetta. Che, rispetto ad altri aspetti delle interazioni patogene ospiti è relativamente sottostudiato. Qui descriviamo le tecniche per analizzare l'efflusso patogeno.
Mostriamo come saggi relativamente semplici possono essere utilizzati per valutare l'efficienza dell'efflux o caratterizzare gli agenti patogeni post-efflux Le tecniche generali qui descritte sono ampiamente applicabili anche se specifici modelli di cellule ospiti patogene possono differire in cinetica, dosaggi ed eventualmente read-out. Come nell'istituire qualsiasi sistema sperimentale, è essenziale stabilire controlli chiari che garantiscano il rispetto di processi biologici autentici in campioni sperimentali o coorti. A dimostrare la procedura sarà Petoria Gayle, una studentessa laureata del mio laboratorio.
Per iniziare con l'esperimento di infezione, utilizzare una pipetta per aggiungere 20 microlitri dell'inoculo Lm appena preparato ai pozzi, con il piatto leggermente inclinato e la punta della pipetta accuratamente posizionata nel supporto sovrasante. Evitare di toccare le pareti del pozzo con la punta della pipetta. Pipettare delicatamente il contenuto di ogni pozzo per garantire una miscelazione completa.
Non agitare o inclinare significativamente la piastra per evitare di stendo LM sulle pareti del pozzo. Riportare il piatto di coltura cellulare al 37 gradi Celsius, l'incubatore di anidride carbonica al cinque%. Utilizzare mezzi condizionati da cellule non infette come diluente per preparare una soluzione di gentamicina da 10 microgrammi per millilitro.
A 30 minuti dopo l'infezione, aggiungere con cura 30 microlitri della soluzione di gentamicina nel piatto per raggiungere una concentrazione finale di due punti-cinque microgrammi per millilitro. Pipettare delicatamente il contenuto del pozzo per mescolare e restituire il piatto di coltura cellulare all'incubatore. Per raccogliere, inclinare leggermente il piatto e utilizzare con cura una pipetta per rimuovere l'intero supporto dal pozzo.
Aggiungere al pozzo millilitri di punto cinque di acqua distillata e sterile. Dopo 30 secondi, trasferire vigorosamente il lysate d'acqua risultante su un tubo di microcentrifugo e vortice di un punto e cinque millilitri per 10 secondi. Aggiungere microlitri a quattro punti e 50 microlitri del litoro d'acqua a 450 microlitri di acqua distillata e sterile per preparare le diluizioni decina e cento volte.
Brevemente vortice per garantire una miscelazione accurata. Aggiungere 50 microlitri dei campioni originali diluiti e cento volte diluiti su piastre di agar di brodo di lisogenia e stenderli utilizzando uno spargitore di piastre. Per saggiare l'LM emergente, estrarre 10 microlitri del supporto di sovrapposizione dal piatto e dividerlo in due aliquote a cinque microlitri e tubi di micro centrifuga.
Aggiungere cinque microlitri di DMEM/FCS a un'aliquota e aggiungere cinque microlitri di DMEM/FCS contenenti cinque microlitri per millilitro gentamicina alla seconda aliquota come controllo. Attendere cinque minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 90 microlitri di acqua sterile distillata ad ogni aliquota e vortice i due vigorosamente per 10 secondi.
Quindi aggiungere 50 microlitri del campione su piastre di agar LB e stendere utilizzando uno spargitore di piastre. Conservare le piastre in incubatore di 37 gradi celsius per due giorni prima di enumerare le colonie Lm. Utilizzando un contatore di celle automatizzato, regolare le cellule preparate, grezze due-sei-quattro-punto-sette alla concentrazione di una per 10 al sesto cellule per millilitro.
Aggiungere un millilitro del campione ai pozzi di una piastra di coltura tissutale a sei pozzi. Infettare le cellule con un inoculo Lm preparato, corrispondente a una molteplicità di infezione di 50. A un punto-cinque ore dopo l'infezione, in un tubo di microcentrifugo a un punto e cinque millilitri riempito con 500 microlitri del quattro per cento di PFA, raccogliere i supporti dal primo set di pozzi e posizionare il tubo sul ghiaccio.
Per raccogliere Lm intracellulare, aggiungere un millilitro di acqua distillata e sterile ad ogni pozzo. Dopo 60 secondi, trasferire il litorato d'acqua risultante in un tubo di microcentrifugo a cinque millilitri con 500 microlitri di PFA al quattro per cento. Vortice vigorosamente il tubo per 10 secondi e posizionarlo sul ghiaccio.
Per i pozzi rimanenti, rimuovere i supporti e sostituirli con un millilitro di DMEM/FCS con cinque microgrammi per millilitro gentamicina per uccidere lm extracellulare.Restituire prontamente il piatto all'incubatore. Dopo 30 minuti, rimuovere i supporti e sostituirli con DMEM/FCS senza gentamicina. Dopo altre due e quattro ore, raccogliere i media in lisati per la seconda e la terza volta punti nei tubi e metterli sul ghiaccio per raffreddarsi.
Tubi di centrifuga a 10.000 volte G per sette minuti. Utilizzando una pipetta, rimuovere il supernatante senza disturbare il pellet. Aggiungere nel tubo un cocktail di colorazione contenente 50 microlitri di PFA al quattro per cento e 15 microlitri di phalloidina e mescolare per sospendere ogni pellet.
Incubare i tubi al buio a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro di tampone FACS a ciascun tubo e pipetta su e giù per mescolare. Tubi di rotazione nella centrifuga a 10.000 volte G per sette minuti.
Rimuovere il supernatante senza disturbare il pellet. Per un uso immediato, sospendere ogni pellet in 400 microlitri di tampone FAX. Se si memorizza per un'analisi successiva, aggiungere 200 microlitri di tampone FAX e 200 microlitri di PFA al quattro per cento nel tubo e mescolare per sospendere.
Utilizzando le condizioni di infezione nel breve trattamento con l'antibiotico gentamicina per eliminare l'Lm non interiorizzato, lo zero-point-one-five percento dell'Lm di tipo selvatico viene recuperato dopo un punto-cinque ore di co-incubazione con macrofagi coltivati. Nella successiva co-incubazione, c'è stato un aumento di quattro e sette punti-cinque volte nel recupero di Lm vitale, che rappresentano esclusivamente la proliferazione intracellulare. Un profilo comparabile è stato osservato per il ceppo Lm che possiede un prfA ipervirulento durante l'infezione iniziale, ma non tra i tre e i sei HPI.
Quando il prfA è stato eliminato dal ceppo Lm, vi è una successiva riduzione del recupero del ceppo dopo una co-incubazione prolungata. Quando la gentamicina viene rimossa dai pozzi a sei HPI, l'Lm extracellulare può essere rilevato un'ora dopo sia per i ceppi di prfA di tipo selvatico che ipervirulento, ma non per il ceppo con prfA eliminato. I supporti sovrapposti sia ai macrofagi non infetti che a quelli infetti contenevano particolato a dispersione della luce, delle dimensioni di un batterio.
Tuttavia, solo i supporti provenienti da macrofagi infetti possedevano segnali positivi gfp all'interno delle dimensioni gating. Un aumento dipendente dal tempo nella comparsa di Lm positivo alla falloidina è stato osservato con macrofagi infetti. Quando si placcano i macrofagi nel piatto di coltura tissutale da 48 po ', lasciare alcuni pozzi senza cellule.
Questi pozzi di controllo senza cellule vengono quindi trattati esattamente allo stesso modo dei pozzi contenenti cellule, in termini di aggiunta dell'agente patogeno, antibiotici, ecc. per garantire che i segnali sperimentali dipendano dalla presenza di cellule ospiti. Analogamente agli esperimenti riportati nelle figure uno e tre, è possibile testare fattori patogeni o ospiti e o piccole molecole sul loro impatto sull'efflusso cellulare patogeno.
