Hücre içi çoğalan mikrobiyal patojenler eninde sonunda enfekte hücreden çıkmalıdır. Hangi, konak patojen etkileşimleri diğer yönleri ile karşılaştırıldığında nispeten az çalışılmıştır. Burada patojen efflux'ü analiz etme tekniklerini tanımlıyoruz.
Biz nispeten basit tahliller ya efflux verimliliği değerlendirmek veya post-efflux patojenleri karakterize etmek için kullanılabilir nasıl göstermek Burada açıklanan genel teknikler genel olarak uygulanabilir olsa da belirli patojen konak hücre modelleri kinetik farklı olabilir, dozajlar ve muhtemelen okuma-outs. Herhangi bir deneysel sistemin kurulmasında olduğu gibi, deneysel numunelerde veya kohortlarda gerçek, biyolojik süreçlerin gözlemlemesini sağlayacak net kontrollerin oluşturulması esastır. Prosedürü gösteren Petoria Gayle, benim laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olacak.
Enfeksiyon deneyi ile başlamak için, çanak biraz eğik ve pipet ucu dikkatle üstteki ortama yerleştirilir, kuyulara taze hazırlanmış Lm inoculum 20 mikrolitre eklemek için bir pipet kullanın. Pipet ucu ile kuyunun duvarlarına dokunmaktan kaçının. Yavaşça tam karıştırma sağlamak için her kuyunun içeriğini pipet.
LM'nin kuyunun duvarlarına yayılmasını önlemek için plakayı sallamayın veya önemli ölçüde eğmayın. Hücre kültürünü 37 santigrat dereceye, %5 karbondioksit kuvöze getirin. Mililitre gentamisin çözeltisi başına 10 mikrogram hazırlamak için dilüent olarak enfekte olmayan hücrelerden klimalı ortam kullanın.
30 dakika sonra enfeksiyon, dikkatle mililitre başına iki nokta-beş mikrogram son konsantrasyonulaşmak için çanak içine gentamisin çözeltisi 30 mikrolitre ekleyin. Yavaşça kuyunun içeriğini karıştırmak ve kuvöze hücre kültürü çanak dönmek için pipet. Hasat için, biraz çanak eğmek ve dikkatle kuyudan tüm medya kaldırmak için bir pipet kullanın.
Kuyuya 5 mililitre distile, steril su ekleyin. 30 saniye sonra, elde edilen suyu 10 saniye boyunca bir nokta-beş mililitrelik mikrosantrifüj tüp ve girdap kuvvetle aktarın. Dört nokta beş mikrolitre ve 50 mikrolitre su damıtılmış, steril su 450 mikrolitre on kat ve yüz kat seyreltme hazırlamak için lysate ekleyin.
Kısa bir süre girdap iyice karıştırma sağlamak için. Lysogeny suyu agar plakaları üzerine orijinal on kat seyreltilmiş ve yüz kat seyreltilmiş örnekleri 50 mikrolitre ekleyin ve bir tabak yayıcı kullanılarak yayıldı. Ortaya çıkan LM için teşp etmek için, çanak bölen medya 10 mikrolitre ayıklayın ve iki beş mikrolitre aliquots ve mikro santrifüj tüpler bölün.
Bir aliquot'a beş mikrolitre DMEM/FCS ekleyin ve kontrol olarak ikinci aliquot'a mililitre başına beş mikrolitre dmem/FCS içeren beş mikrolitre DMEM/FCS ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika bekleyin. Her aliquot ve girdap 10 saniye boyunca şiddetle iki distile steril su 90 mikrolitre ekleyin.
Sonra LB agar plakaları üzerinde örnek 50 mikrolitre ekleyin ve bir plaka dağıtıcı kullanarak yayıldı. Lm kolonilerini sayısallandırmadan önce plakaları 37 santigrat derecede iki gün saklayın. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak, hazırlanan, ham iki-altı-dört noktalı yedi hücreyi mililitre başına altıncı hücreye bir kere 10'luk konsantrasyona ayarlayın.
Altı kuyulu doku kültürü plakası kuyularına bir mililitre numune ekleyin. 50 enfeksiyon çokluğu karşılık gelen, hazırlanmış bir Lm inoculum ile hücreleri enfekte. Enfeksiyon sonrası bir noktadabeş saat, bir nokta-beş mililitre likit mikrosantrifüj tüp yüzde dört PFA 500 mikrolitre ile dolu, kuyuların ilk kümesinden medya toplamak ve buz üzerinde tüp yerleştirin.
Hücre içi Lm toplamak için, her kuyuya bir mililitre distile, steril su ekleyin. 60 saniye sonra, elde edilen suyu bir nokta-beş mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 500 mikrolitre likit dört%PFA ile. Tüpü 10 saniye boyunca şiddetle girve buza yerleştirin.
Kalan kuyular için, medya kaldırmak ve mililitre başına beş mikrogram mililitre gentamicin ile dmem / FCS bir mililitre ile değiştirin mililitre lm.Promptly kuvöz için çanak dönmek öldürmek için. 30 dakika sonra, ortamı çıkarın ve gentamisin olmadan DMEM/FCS ile değiştirin. Başka bir iki ve dört saat sonra, tüpler içine ikinci ve üçüncü kez puan için lysates medya toplamak ve soğuması için buz üzerine yerleştirin.
Santrifüj tüpleri 10, 000 kez G yedi dakika. Pipet kullanarak, pelet rahatsız etmeden supernatant çıkarın. Tüp içine yüzde dört PFA ve 15 mikrolitre phalloidin 50 mikrolitre içeren boyama kokteyli ekleyin ve her pelet askıya almak için karıştırın.
Tüpleri karanlıkta 20 dakika boyunca 4 derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, her tüp ve pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için FACS tampon bir mililitre ekleyin. Yedi dakika boyunca 10,000 kez G santrifüj de spin tüpler.
Peletrahatsız etmeden supernatant çıkarın. Hemen kullanım için, FAKS tampon 400 mikrolitre her pelet askıya alın. Daha sonra analiz için depolama, 200 faks tampon ve tüp içine yüzde dört PFA 200 mikrolitre ekleyin ve askıya almak için karıştırın.
Antibiyotik gentamisin ile kısa tedavide enfeksiyon koşulları kullanılarak içselleştirilmeyen Lm ortadan kaldırmak için, yabani tip Lm sıfır nokta-bir-beş yüzde kültürlü makrofajlar ile co-inkübatasyon bir nokta beş saat sonra kurtarılır. Sonraki eş-kuluçka, sadece hücre içi proliferasyonu temsil canlı Lm kurtarma dört kat ve yedi nokta beş kat artış oldu. İlk enfeksiyon sırasında hipervirulent prfA'ya sahip lm suşu için karşılaştırılabilir profil gözlendi, ancak üç ile altı HPI arasında değildi.
PrfA Lm suşundan silindiğinde, uzun süreli eş kuluçkadan sonra gerilmede bir azalma meydana gelir. Gentamisin altı HPI'deki kuyulardan çıkarıldığında, hücre dışı Lm bir saat sonra hem yabani tip hem de hipervirulent prfA suşları için tespit edilebilir, ancak prfA ile yapılan zorlanma için saptanabilir. Hem enfekte olmayan hem de enfekte olmuş makrofajların örtünmesi, ışık saçılımı, bakteri büyüklüğünde partikül madde içeriyordu.
Ancak, sadece enfekte makrofajlardan medya boyutu gating içinde GFP pozitif sinyalleri sahip. Enfekte makrofajlarda phalloidin pozitif Lm görünümünde zamana bağlı bir artış gözlendi. 48-iyi doku kültürü çanak makrofajlar dışarı kaplama zaman, hücre olmadan bazı kuyular bırakın.
Bu hücre dışı kontrol kuyuları daha sonra, deneysel sinyallerin konak hücrelerinin varlığına bağlı olduğundan emin olmak için patojen, antibiyotikler vb. eklenmesi açısından hücre içeren kuyularla tamamen aynı şekilde tedavi edilir. Birinci ve üçüncü şekillerde gösterilen deneylere benzer şekilde, patojen veya konak faktörleri ve veya küçük moleküller patojen hücresel efflux üzerindeki etkileri açısından test edilebilir.
