שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מהותיות בתחום השמיעה והאיזון. הוא מתאר כיצד לזהות שני היבטים חשובים של תפקוד תאי שיער חושיים, mechanotransduction ופעילות presynaptic. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מאפשרת לנו לדמיין את תפקודם של תאי השיער בבעל חיים, וללמוד כיצד אוספים של תאי שיער מזהים ומעבירים מידע חושי.
כדי להתחיל בהליך זה, השתמש מטלפים עדין חוט טונגסטן לעצב את הסיכות לשמש כדי לשתק את הזחל דרך הראש והזנב, על אנקפסולנט מוקשה. כדי להפוך את סיכות הראש, להחזיק חתיכה של חוט טונגסטן 0.035 מילימטר ביד אחת. באמצעות ממטרים עדין ביד השנייה, לכופף את החוט מילימטר אחד מהסוף, ב 90 מעלות.
החלף את המדפים עבור מספריים עדין, וחתוך מילימטר אחד לאחר העיקול, כדי ליצור את הסיכה. לאחר מכן השתמש במטסים כדי להכניס את הפינים לתוך encapsulate מוקשה על התא. מקם את הזחל במרכז תא הזלוב כך שהוא שוכב שטוח על צידו מול אנקפסולנט הסיליקון.
באמצעות ממטרות עדין, להביא את סיכת הראש 0.035 מילימטר למטה בניצב לזחל. הכנס את סיכת הראש בין העין לווטיק, ולמטה לתוך העכום. השתמש קבוצה שנייה של מדפים כדי לייצב את הזחל לאורך הצד הגבי והגחוני שלה, תוך הצמדה.
ודא כי החלק האופקי של הסיכה יוצר קשר עם הזחל ואינו לוחץ כל הדרך לתוך encapsulant. זווית הסיכה באופן חד-אוורורי, או הצבעה מעט לכיוון החלק העליון של הזחל, כדי למנוע הפרעה להזרקת הלב והדמיית תאי השיער הבאים. באמצעות המדפים, הכנס סיכת זנב של 0.025 מילימטר לתוך הנוכורד, קרוב ככל האפשר לסוף הזנב.
כדי להזריק אלפא bungarotoxin לתוך הזחל, backfill שלושה microliters של הפתרון לתוך מחט ההזרקה, באמצעות קצה פיפטה טעינת ג'ל. לטעון את הפתרון באופן שווה לקצה, ללא בועות. ואז להכניס את מחט הזרקת הלב לתוך מחזיק פיפטה מחובר מיקרומניפולטור ידני.
תחת מיקרוסקופ סטריאו, מקם את המחט כך שהיא מיושרת בניצב לציר AP של הזחל הרדמה, מצביע למטה בזווית של 30 מעלות. לאחר מכן, חבר את מחזיק הפיפיטים למזרק הלחץ. להזריק בולוס של אלפא bungarotoxin לתוך הפתרון, כדי לבדוק אם קצה המחט ברור.
אם לא נראה צבע אדום, בעדינות רבה לגרד את קצה המחט על קצה סיכה, ולנסות שוב, עד המחט ברורה. לאחר מכן, לקדם את המחט לכיוון הלב, עד שהוא נוגע בעור מחוץ ללב. לחץ את המחט לתוך הזחל, ולחפש חריץ של תא הפיגמנט על העור מול הלב כדי להבטיח כי המחט ממוקמת במישור הנכון, יחסית לזחל.
לאחר מכן, לקדם את המחט רחוק יותר, עד שהוא חודר את העור ונכנס לחלל הלב. משוך את המחט בחזרה מעט, ולהזריק בולוס של אלפא bungarotoxin לתוך חלל הלב. חפש אינפלציה של חלל הלב, או צבע אדום נכנס לחלל.
יש לשטוף בעדינות את הזחל שלוש פעמים, עם מיליליטר אחד של חיץ עצבי כדי להסיר את שאריות MS222. לעולם אל תסיר את כל הנוזלים. לשמור על זחל בערך 1 מיליליטר של חיץ עצבי בתא זלבן.
בהליך זה backfill 10 microliter של חיץ neronal לתוך מחט נוזלי סילון שבור כראוי באמצעות קצה טעינת ג'ל. לטעון את הפתרון באופן שווה לקצה ללא בועות. לאחר מכן, הכנס את המחט למחזיק הפיפסה המחובר למיקרומניפולטור ממונע.
מניחים את תא הנזילה במתאם תא עגול על שלב המיקרוסקופ. הזז את השלב ממונע כך שהזחל יהיה במרכז שדה המבט. לאחר מכן, סובבו את מתאם התא המעגלי כך שהגישה ל- AP לזחל מיושרת בערך עם המסלול של מחט סילון הנוזלים.
באמצעות אור משודר וניגודיות הפרעה דיפרנציאלית, להביא את הזחל לפוקוס ולרכז אותו תחת המטרה 10x. לאחר מכן, להעלות את המטרה 10x. באמצעות מיקרומניפולטור ממונע, להביא את מחט סילון נוזל למטה למרכז שדה המבט, כך הוא מואר על ידי האור המועבר בקושי נוגע חיץ עצבי.
הורידו את המטרה של 10x להתמקד בזחל כדי לאשר את מיקומו. תמזג את המטרה על מחט סילון הנוזלים. הזז את מחט סילון הנוזלים עם המיקרומניפולטור בציר x ו- y עד שהוא נמצא במיקום מקביל לצד הגבי של הזחל.
לאחר מכן, להתמקד בחזרה על הזחל. מביאים את המחט למטה בציר z וממקמים את המחט לאורך הצד הגבי של הדג, 1 מילימטר מהגוף. בזהירות להזיז את מתאם התא המעגלי כדי להבטיח כי מחט סילון נוזל מיושר לאורך קו האמצע AP של הזחל.
לאחר מכן, עבור למטרה 60x מים. ודא כי המטרה היא emersed במאגר העצבי. השתמש בפוקוס עדין כדי לאתר נוירומאסט.
לאחר מכן להזיז את השלב motarized כדי למקם את הנוירו-מוסט של עניין במרכז השדה של הנוף. שמור את קצה מחט סילון הנוזל לאורך הצד הגבי של הדג. אין לגעת בקצה מחט הנוזל-סילון אל הזחל או אל פני התא.
מקם את מחט סילון הנוזלים עם המיקרומניפולטור כך שהוא 100 מיקרומטר מהקצה החיצוני של הנוירומאסט. לאחר מכן, להתמקד עד קצות חבילות שיער apical. החלק התחתון של מחט סילון הנוזלים צריך להיות בפוקוס במישור הזה.
הגדר את מהדק הלחץ במהירות גבוהה מהמדריך למצב חיצוני כדי לקבל קלט מתוכנת ההדמיה. אפס את מהדק הלחץ במהירות גבוהה על ידי לחיצה על כפתור האפס, ולהשתמש בידית הנקודה להגדיר כדי להגדיר את לחץ המנוחה מעט חיובי. אשר את תפוקת המנוחה של מהדק הלחץ במהירות גבוהה באמצעות מד מאנימטר PSI המחובר לפלט שלב הראש.
כדי לקבוע את הלחץ הדרוש כדי לעורר את חבילות השיער, להחיל גירוי מבחן עם 0.125 ו 0.25 וולט פלט עבור 200-500 אלפיות שנייה. עבור כל גירוי מבחן, למדוד את המרחק של הסטה של קצות hairbundles, קינוקיליה. בחרו לחץ שמזיז את החבילות למרחק של כ-5 מיקרומטרים.
ודא כי קצות הקינוקיליה להישאר בפוקוס כל הזמן. כדי להשיג תמונות במישור יחיד, בחר גירוי למשלוח במהלך רכישת 80 המסגרות, לאחר מסגרת 30, ב- 3 שניות. כדי למדוד תגובות סידן מכני, להתמקד בבסיס של חבילות שיער apical ולהתחיל רכישת תמונה.
כדי למדוד תגובות סידן presynaptic, להתמקד בבסיס של תאי השיער, ולהתחיל רכישת תמונה. השלבים כדי לדמיין את השינויים spatiotemporal בעוצמת GCaMP6S, בתוך נוירומאסט במהלך הסימולציה, מתוארים כאן. הזמן מיוצג משמאל לימין בהתאם לחותמת הזמן.
השורה העליונה מציגה חמישה מתוך 14 סלים זמניים מתוך רצף תמונות GCaMP6S F בן 70 פריימים. בשורה השניה, תוכנית הבסיס הוסרה מכל תמונה מקופלת GCaMP6S F ליצירת תמונות דלתא F. בשורה השלישית, תמונות דלתא F הומרו מסקאלה אפורה לטבלת בדיקת מידע אדומה חמה.
בשורה התחתונה, השורה השלישית שכבה על תמונות F בשורה העליונה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לוודא שהזחל מוצמד כראוי ולהשתמש בפקדים מתאימים, כמתואר בכתב היד כדי לא לכלול חפצי תנועה מהנתונים שלך. עבודה עם אלפא בונגרוטוקסין יכולה להיות מסוכנת.
חשוב לנקוט אמצעי זהירות, כגון לבישת כפפות בעת הטיפול בו.
