באמצעות פרוטוקול זה, כל מעבדה שיש לה מיקרוסקופ קונפוקלי סטנדרטי המצויד בלייזר 405 ננומטר יכולה לבצע אבלציות לייזר של תאי שיער ולפקח על התחדשותם. שלא כמו אלקטרו-אבלציה, טכניקה זו מגבילה נזקים לתאים הסובבים והיא נגישה יותר מהגדרת לייזר UV רבת עוצמה. הדמיה קונפוקלי יכול להתבצע גם מיד לפני ואחרי אבלציה.
טכניקה זו מאפשרת לנו להבין טוב יותר את ההתנהגות הרגנרטיבית של אבי החושים, אשר עשוי לסייע בפיתוח טיפולים לאובדן שמיעה אנושי. להרכבה, פיפטה הראשונה שלוש עד ארבע זחלים הרדמה לתוך טיפה קטנה של פתרון טריקאין E3 למרכז המנה 35 מילימטר, עם 14 מילימטר מספר 1.5 לכסות להחליק התחתון. הסר את הפתרון העודף, כך הזחלים להישאר טיפה קטנה רק גדול מספיק כדי להכיל אותם.
ומ מניחים את המנה על הבמה של מיקרוסקופ סטריאו משקפת. לתפעל את הזום ולהתמקד כך שכל הזחלים נמצאים בשדה התצוגה ולהשתמש פיפטה העברה להוסיף שכבה דקה של פתרון אגרו על להחליק את הכיסוי. הסר את האגרוס העודף עד שהנוזל פשוט ממלא את הטוב בתחתית המנה, דואג לא להשראה לזחלים.
ולהשתמש בסכין שיער כדי לכוון במהירות את הזחלים בתסרון האגרו עם הצד rostral פונה שמאלה. לחץ בעדינות על הזחלים כלפי מטה כנגד הזכוכית, כך שהזחלים שוכבים בפרופיל כאשר הצדדים הימניים שלהם פונים כלפי מטה. לאחר כ-60 שניות, האגרוס יתחיל להתגבש והזחלים לא יוכלו להיות מוכוון מחדש.
לאחר חמש דקות, השתמש פיפטה העברה כדי למלא את המנה באמצע הדרך עם E3 בתוספת טריקאין 1X. כדי לאתר מטרות פוטנציאליות, הפעל את הכוח למערכת המיקרוסקופיה הקונפוקית לסריקת לייזר ואתחל את הלייזר באמצעות תוכנת ההדמיה המשולבת. בחרו את מטרת טבילת השמן 63X Plan-Apochromat והחלו שמן טבילה על העדשה.
אבטחו את המנה בהכנסת שלב עגולה עם ההיבט הרוזלי של הזחלים הפונים שמאלה. באמצעות שדה בהיר או תאורת ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית, בחר אחד הזחלים המותקנים להדמיה ולהשתמש ידית המיקוד כדי להביא את העור בצד של הדג הקרוב ביותר לכיסוי להחליק לתוך המוקד. עבור לתאורה אפיפלורסנטית בערוץ GFP ואתר את הקו האחורי לצדדים על ידי ביטוי GFP לאורך מיוספטום אופקי.
טבעות של תאים פלואורסצנטיים מעידות על תאי המעטפת הנוירו-מוסטים וגדילים מוארכים של תאים הם תאי ההתמחות. החל מנוירומטום הפריפורדיום הנודד הראשון, השתמש בהיגוי בקרת הבמה כדי לסרוק באופן חזותי באופן סיבתי לאורך המיוספטום האופקי. בעקבות המחרוזת של תאי interneuromast עד האזור בין השלישי והרביעי נודדים primordium neuromasts הוא הגיע.
אם יש לדמיין מספר זחלים, בחרו מיקום למיקום השלב הראשון. לאחר שזוהו גופי תאים באזור L3, L4, עבור למצב רכישה ולהשתמש בלייזר המתאים כדי להפעיל את מסלול ההדמיה GFP. כדי להוסיף ערוץ אור משודר למסלול הלייזר המופעל, לחץ על התיבה T-PMT בתפריט הנפתח של הגדרת ההדמיה.
כדי לדמיין זחלי ET20, בחר בלייזר 488 ננומטר, הגדר את כוח הלייזר ל- 6% מגודל חור הסיכה ליחידת שטח אחת שוות ערך ואת הרווח הדיגיטלי ל- 750. התאימו את הרווחים כך שגופם של התאים יהיה רווי כדי ללכוד תחזיות עמומות ופילופודיה. והגדר את גודל המסגרת ל- 1, 024 על 1, 024 פיקסלים, הממוצע לשניים וההגדלה הדיגיטלית ל- 0.7.
סמן את התיבה מחסנית Z כדי להעלות את התפריט הנפתח מיקום Z. תוך כדי סריקה מהירה, התמקדו עד שתאי ה-interneuromast פשוט יצאו מפוקוס והגדירו את הפרוסה הראשונה. התמקדו בדגימה עד שתאי ה-interneuromast שוב יצאו מהפוקוס והגדירו את הפרוסה האחרונה.
לאחר מכן לחץ על עצור ולחץ על התחל ניסוי כדי ללכוד מחסנית Z טרום-אבלציה. אם נוספו מיקומי הבמה, בטל את הפעלת אפשרות המיקומים כך שרק המיקום הנוכחי ידמיין וישמור את הקובץ לאחר לכידתו. לקבלת אבלציה בלייזר של גופי התאים הממוקדים, לחץ על הצג את כל הכלים בממשק הרכישה ובתפריט הגדרת ההדמיה, בחר הוסף רצועה חדשה.
לחץ על צבע ובחר DAPI. תחת ערוצים, בחר 405 עבור הגדרת הלייזר והגדל את כוח הלייזר ל- 75%Unclick של ערוץ DAPI כדי לכבות את הלייזר בעת סריקה לאיתור גופי תאים מועמדים לקבלת אבלציה. לחץ בשידור חי ועם הגוף של תא interneuromast מרוכז בשדה התצוגה, זום לתוך מסגרת הסריקה ל 20 עד 22X.
הפסק את הסריקה החיה ברגע שגוף התא ימלא את שדה התצוגה. בדוק את תיבת תריס לייזר 405 ננומטר כדי להפעיל את המסלול ולהגדיר טיימר במשך 45 שניות. לאחר מכן, הפעל סריקה רציפה והפעל את שעון הזמן.
מיד לעצור את הסריקה ב 45 שניות. להדמיה של גופי התא לאחר אבלציה, מתחת לתפריט הערוצים, בטל את הרצועה DAPI כדי להשבית את לייזר אבלציה ולפתוח את תפריט מצב הרכישה. לחץ על שנה גודל תצוגה והקטין את גודל התצוגה ל- 0.7.
כדי להעריך את ההצלחה של אבלציה התא, לסרוק במהירות את שדה התצוגה. שימוש באותן הגדרות כמו אלה עבור דימות טרום אבלציה, ללכוד ולשמור תמונה שלאחר אבלציה. בדוק את תמונת ערוץ הצינור photomultiplier אור משודר כדי לאשר עוד יותר את הנזק התאי.
תאים פגומים ידגימו מראה פרטני והגרעין יתנפח לעתים קרובות או ייראה לא סדיר בצורתו. כדי להעריך את התאוששות גוף התא שלאחר אבלציה, הפעל הן את מיקום הבמה והן את אפשרויות הזמן ללכידת תמונה לשגות בזמן והגדר את פרמטרי הזמן לנקודת הזמן הניסיונית המתאימה ומרווחי זמן של 15 דקות. לאחר מכן, התחל את הניסוי כדי להשיג תמונות ולשמור את הקובץ שנוצר לאחר השלמתו.
בניסוי מייצג זה זוהה אזור הקו הצדדי הממוקם בין הנוירומסטים הנודדים השלישי והרביעי נודדים ותמונות טרום אבלציה נלכדו. סריקה שלאחר אבלציה אישרה כי לא נשארו גופות תאים באזור האבלציה. השארת פער בין התחזיות המוארכות של תאי ההתמחות הסמוכים.
ניתוח של ערוץ צינור photomultiplier אור משודר לאחר אבלציה, מגלה תאים פגומים וגוססים. מסומן על ידי גרעינים נפוחים בצורה לא סדירה ומראה פרטני. גיוס של תאים אמובואידיים גדולים כי הם מקרופאגים סביר גם ניתן לראות.
בניסוי זה, אבלציה של מספר תאים בזחלים המהומשים הכפולים יצרה פערים ניכרים במחרוזת התאים interneuromast, אך הייתה לה השפעה מועטה או ללא השפעה על עצב הקו בצד השני. לאחר אבלציה בלייזר, גדלי הפער ניתן למדוד. החל מכמה מיקרונים ועד 100 מיקרון, בהתאם לרוחב שתאי הנוירו-מאסט הבודדים וכמה תאים נבחרים לאבלציה.
לאחר אבלציה, כמה תאים interneuromast להתאושש בתוך השעות הראשונות של הדמיה. עם ההסתברות לסגירת פערים בקורלציה שלילית עם גודל הפער. אפילו בתאי interneuromast שאינם מסוגלים להתאושש עם זאת, היווצרות של תחזיות ארוכות מתאי interneuromast השכנים, אשר יכול להידמות הארכת קונוסים צמיחה עצבית ניתן לראות.
חשוב לבדוק ביסודיות את ערוץ T-PMT לתאים פגומים המציגים גרעינים וצפיפות בצורה לא סדירה, ולאפשר מספיק זמן לאינדיקטורים אלה של מוות תאי להיות גלויים. ניתוח נוסף של נתוני המיקרוסקופיה הנובעים מזמן לשגות, יכול לחשוף התנהגויות תאיות חדשניות הנגרמות על ידי אבלציה בלייזר ועשוי להנחות את הפיתוח של ניסויים לזיהוי וסתים של התחדשות. טכניקה זו אפשרה לנו ללמוד את הרגולטורים המולקולריים של התחדשות תאי interneuromast על ידי מתן שיטה מהירה וחסכונית לפגיעה סלקטיבית בתאים אלה.
