Este método puede ayudar a responder preguntas fundamentales en el campo de la audición y el equilibrio. Describe cómo detectar dos aspectos importantes de la función de las células pilosas sensoriales, la mecanotransducción y la actividad presináptica. Las principales ventajas de esta técnica son que nos permite visualizar el funcionamiento de las células pilosas en un animal vivo, y estudiar cómo las colecciones de células pilosas detectan y transmiten información sensorial.
Para comenzar este procedimiento, utilice fórceps finos y alambre de tungsteno para crear los pines que se utilizarán para inmovilizar la larva a través de la cabeza y la cola, en el encapsulante endurecido. Para hacer pasadores de cabeza, sostenga un pedazo de alambre de tungsteno de 0.035 milímetros en una mano. Usando fórceps finos en la otra mano, doble el alambre un milímetro hacia arriba desde el extremo, a 90 grados.
Cambie los fórceps por tijeras finas, y corte un milímetro después del pliegue, para crear el pasador. A continuación, utilice fórceps para insertar los pasadores en el encapsulado endurecido en la cámara. Coloque la larva en el centro de la cámara de perfusión de modo que quede plana de lado contra el encapsulante de silicona.
Usando fórceps finos, lleve el pasador de cabeza de 0.035 milímetros hacia abajo perpendicular a la larva. Inserte el pasador de la cabeza entre el ojo y la vesícula otic, y hacia abajo en el encapsulante. Utilice un segundo conjunto de fórceps para estabilizar la larva a lo largo de su lado dorsal y ventral, mientras se fija.
Asegúrese de que la parte horizontal del pasador entra en contacto con la larva y no presiona todo el camino en el encapsulante. Angulo el pasador ventralmente, o apuntando ligeramente hacia la parte anterior de la larva, para evitar interferir con la inyección cardíaca posterior y las imágenes de las células pilosas. Usando los fórceps, inserte un pasador de cola de 0.025 milímetros en el notochord, lo más cerca posible del extremo de la cola.
Para inyectar alfa bungarotoxina en la larva, rellene tres microlitros de la solución en la aguja de inyección, utilizando una punta de pipeta de carga de gel. Cargue la solución uniformemente en la punta, sin burbujas. A continuación, inserte la aguja de inyección cardíaca en un soporte de pipeta unido a un micromaniprógrafo manual.
Bajo un microscopio estéreo, coloque la aguja de modo que esté alineada perpendicularmente al eje AP de la larva anestesiada, apuntando hacia abajo en un ángulo de 30 grados. A continuación, conecte el soporte de la pipeta al inyector de presión. Inyectar un bolo de alfa bungarotoxina en la solución, para comprobar si la punta de la aguja está clara.
Si no se ve ningún color rojo, raspe suavemente la punta de la aguja contra el borde de un alfiler, e inténtelo de nuevo, hasta que la aguja esté limpia. Posteriormente, avance la aguja hacia el corazón, hasta que toque la piel fuera del corazón. Presione la aguja en la larva y busque la sangría de la célula pigmentaria en la piel delante del corazón para asegurarse de que la aguja se coloca en el plano correcto, en relación con la larva.
Luego, avance la aguja más lejos, hasta que perfore la piel y entre en la cavidad cardíaca. Tire de la aguja hacia atrás ligeramente, e inyecte un bolo de alfa bungarotoxina en la cavidad cardíaca. Busque la inflación de la cavidad cardíaca, o el tinte rojo que entra en la cavidad.
Enjuague suavemente la larva tres veces, con un mililitro de tampón neuronal para eliminar el MS222 residual. Nunca retire todo el líquido. Mantener la larva en aproximadamente 1 milímetro de tampón neuronal en la cámara de perfusión.
En este procedimiento rellene 10 microlitros de tampón neronal en una aguja de chorro de fluido correctamente rota utilizando una punta de carga de gel. Cargue la solución uniformemente en la punta sin burbujas. A continuación, inserte la aguja en el soporte de la pipeta unido al micromaniprógrafo motorizado.
Coloque la cámara de perfusión en un adaptador de cámara circular en la etapa del microscopio. Mueva la etapa motorizada para que la larva esté en el centro del campo de visión. Posteriormente, gire el adaptador de cámara circular para que el acceso AP a la larva esté más o menos alineado con la trayectoria de la aguja de chorro de fluido.
Usando el contraste de luz y interferencia diferencial transmitida, ponga la larva en el foco y céntrela bajo el objetivo 10x. A continuación, suba el objetivo 10x. Usando el micromaniprógrafo motorizado, baje la aguja de chorro de fluido al centro del campo de visión, para que se ilumine por la luz transmitida y apenas toque el tampón neuronal.
Bajar el objetivo 10x para centrarse en la larva con el fin de confirmar su ubicación. Fuous el objetivo en la aguja de chorro de fluido. Mueva la aguja de chorro de fluido con el micromaniprulador en el eje X e Y hasta que esté en una posición paralela al lado dorsal de la larva.
Después, concéntrate en la larva. Lleve la aguja hacia abajo en el eje z y coloque la aguja a lo largo del lado dorsal del pez, a 1 milímetro del cuerpo. Mueva con cuidado el adaptador de cámara circular para asegurarse de que la aguja de chorro de fluido esté alineada a lo largo de la línea media AP de la larva.
A continuación, cambie al objetivo de agua 60x. Asegúrese de que el objetivo se emeje en el búfer neuronal. Usa el enfoque fino para localizar a un neuromasta.
Posteriormente mueva la etapa motarizada para colocar el neuromasta de interés en el centro del campo de visión. Mantenga la punta de la aguja de chorro de líquido a lo largo del lado dorsal del pez. No toque la punta de la aguja de chorro de fluido a la larva o a la superficie de la cámara.
Coloque la aguja de chorro de fluido con el micromaniprógrafo de modo que esté a 100 micrómetros del borde exterior del neuromasta. Luego, concéntrate en las puntas de los haces de pelo apical. La parte inferior de la aguja de chorro de fluido debe estar enfocada en este plano.
Ajuste la abrazadera de presión de alta velocidad del manual al modo externo para recibir la entrada del software de imágenes. Cero la abrazadera de presión de alta velocidad pulsando el botón cero, y utilice la perilla de punto de ajuste para ajustar la presión de reposo ligeramente positiva. Confirme la salida de reposo de la abrazadera de presión de alta velocidad utilizando un manómetro PSI conectado a la salida de la etapa de la cabeza.
Para determinar la presión necesaria para estimular los haces capilares, aplique un estímulo de prueba con una salida de 0.125 y 0.25 voltios para 200-500 milisegundos. Para cada estímulo de prueba, medir la distancia de desviación de las puntas de las horquillas, la kinocilia. Elija una presión que mueva los haces a una distancia de aproximadamente 5 micrómetros.
Asegúrese de que las puntas de la kinocilia permanezcan enfocadas todo el tiempo. Para adquirir imágenes de un solo plano, seleccione un estímulo para entregar durante la adquisición de 80 fotogramas, después del fotograma 30, a 3 segundos. Para medir las respuestas mecanosensibles al calcio, concéntrese en la base de los haces de cabello apical e inicie la adquisición de imágenes.
Para medir las respuestas presinápticas de calcio, concéntrese en la base de las células pilosas e inicie la adquisición de imágenes. Los pasos para visualizar los cambios espaciotemporales en la intensidad GCaMP6S, dentro de un neuromasta durante la simulación, se describen aquí. El tiempo se representa de izquierda a derecha según la marca de tiempo.
La fila superior muestra cinco de las catorce ubicaciones temporales de una secuencia de imágenes GCaMP6S F de 70 fotogramas. En la segunda fila, la línea base se ha eliminado de cada imagen con binned GCaMP6S F para crear imágenes delta F. En la tercera fila, las imágenes delta F se han convertido de escala de grises a tabla de búsqueda al rojo vivo.
En la fila inferior, la tercera fila se ha superpuesto a las imágenes F de la fila superior. Al intentar este procedimiento, es importante recordar asegurarse de que la larva está anclada correctamente y utilizar los controles adecuados, como se describe en el manuscrito para excluir artefactos de movimiento de sus datos. Trabajar con bungarotoxina alfa puede ser peligroso.
Es importante tomar precauciones, como usar guantes mientras lo manipulas.
