Этот метод может помочь ответить на фундаментальные вопросы в области слуха и равновесия. В нем описывается, как обнаружить два важных аспекта функции сенсорных волосковых клеток, механотрансдукции и пресинаптической активности. Основными преимуществами этой техники являются то, что она позволяет визуализировать функцию волосковых клеток у живого животного, а также изучать, как коллекции волосковых клеток обнаруживают и передают сенсорную информацию.
Чтобы начать эту процедуру, используйте тонкие типсы и вольфрамовый провод, чтобы мода булавки, которые будут использоваться для обездвиживания личинки через голову и хвост, на затвердевший инкапсулант. Чтобы сделать голову булавки, держать кусок 0,035 миллиметр вольфрама проволоки в одной руке. Используя тонкие миппы в другой руке, согните провод на один миллиметр вверх от конца, при 90 градусах.
Обменяйте типсы на тонкие ножницы и вырежьте один миллиметр после изгиба, чтобы создать штифт. Затем используйте типсы, чтобы вставить булавки в затвердевшие инкапсулировать на камеру. Распоитить личинку в центре перфузионой камеры так, чтобы она лежит на боку против силиконового инкапсулянта.
Используя тонкие миппы, принесите 0,035-миллиметровую головку штырь перпендикулярно личинке. Вставьте головной штифт между глазом и везикулой, и вниз в инкапсулант. Используйте второй набор типсов для стабилизации личинки вдоль спинной и брюшной стороны, при этом закрепление.
Убедитесь, что горизонтальная часть штифта контактирует с личинкой и не прижимается всю дорогу к инкапсуланту. Угол контактный брюшной, или указывая немного к передней части личинки, чтобы избежать вмешательства в последующую инъекцию сердца и волосяной клетки изображения. Используя типсы, вставьте 0,025-миллиметровый хвостовой штифт в нотохорд, как можно ближе к концу хвоста.
Чтобы ввести альфа-бунгаротоксин в личинку, заполнив три микролитров раствора в инъекционной игле, используя гель-загрузку пипетки наконечник. Загрузите раствор равномерно на кончик, без пузырьков. Затем вставьте иглу для инъекций сердца в держатель пипетки, прикрепленный к ручному микроманипулятору.
Под стерео микроскопом, положение иглы, чтобы она выровнена перпендикулярно оси AP обезболивающей личинки, указывая вниз под углом 30 градусов. Затем соедините держатель пипетки с инжектором давления. Введи болюс альфа-бунгаротоксина в раствор, чтобы проверить, является ли кончик иглы ясным.
Если не видно красного цвета, очень осторожно соскребать кончик иглы против края булавки, и попробуйте еще раз, пока игла не будет ясной. Впоследствии, заранее иглы к сердцу, пока он не касается кожи за пределами сердца. Нажмите иглу в личинку, ищите отступ пигментной клетки на коже перед сердцем, чтобы убедиться, что игла расположена в правильной плоскости, по отношению к личинке.
Затем, заранее иглы дальше, пока он не пронзает кожу и входит в полость сердца. Потяните иглу обратно немного, и ввести болюс альфа-бунгаротоксин в полость сердца. Ищите инфляцию полости сердца, или для красного красителя, поступающих в полость.
Аккуратно промыть личинку три раза, с одним миллилитр нейронального буфера, чтобы удалить остаточный MS222. Никогда не удаляй всю жидкость. Поддержание личинки примерно в 1 миллилетере нейронального буфера в перфузионной камере.
В этой процедуре backfill 10 микролитер неронального буфера в правильно сломанной жидкости струи иглы с помощью гель загрузки отзыв. Загрузите раствор равномерно на кончик без пузырьков. Затем вставьте иглу в держатель пипетки, прикрепленный к моторизованной микроманипулятору.
Поместите перфузионную камеру в круговой адаптер камеры на стадии микроскопа. Перемести моторизованную сцену так, чтобы личинка была в центре поля зрения. Впоследствии поверните адаптер круговой камеры так, чтобы доступ AP к личинке был примерно выровнен с траекторией жидкостно-струйной иглы.
Используя передаваемый контраст света и дифференциальных помех, привести личинку в фокус и центр его под 10x цели. Затем поднимите цель 10x. Используя моторизованный микроманипулятор, принесите жидкостно-струйную иглу вниз в центр поля зрения, поэтому она освещается передаваемым светом и едва касаясь нейронального буфера.
Нижняя цель 10x сосредоточиться на личинке, чтобы подтвердить свое местоположение. Fuous цель на жидкости струи иглы. Перемещение жидкости струи иглы с микроманипулятором в х и у оси, пока он находится в положении параллельно спинной стороне личинки.
После этого сосредоточьтесь на личинке. Принесите иглу вниз в z-оси и положение иглы вдоль спинной стороны рыбы, 1 миллиметр от тела. Тщательно переместите адаптер круговой камеры, чтобы убедиться, что струйная игла жидкости выровнена вдоль средней линии AP личинки.
Далее переключитесь на 60-х водную цель. Убедитесь, что цель находится в нейронной буфер. Используйте тонкий фокус, чтобы найти нейромаст.
Затем перемести мотаризованную стадию, чтобы поместить нейромаст интереса в центр поля зрения. Держите жидкость струи иглы отзыв вдоль спинной стороне рыбы. Не прикасайтесь к наконечнику иглы с жидкостью или поверхности камеры.
Распоистите жидкостно-струйную иглу с микроманипулятором так, чтобы она была в 100 микрометрах от внешнего края нейромаста. Затем сосредоточьтесь на кончиках апических пучков волос. В нижней части жидкости струи иглы должны быть в центре внимания в этой плоскости.
Установите высокоскоростной зажим давления из ручного во внешний режим для получения входных данных от программного обеспечения для визуализации. Нулевой высокоскоростной зажим давления, нажав на нулевую кнопку, и использовать ручку точки набора, чтобы установить давление отдыха немного положительным. Подтвердите выход зажима высокого скоростного давления с помощью манометра PSI, прикрепленного к выходу ступени головы.
Чтобы определить давление, необходимое для стимулирования волос расслоения, применить тест стимул с 0,125 и 0,25 вольт выход для 200-500 миллисекунд. Для каждого теста стимул, измерить расстояние отклонения кончиков hairbundles, киноцилия. Выберите давление, которое перемещает пучки на расстояние около 5 микрометров.
Убедитесь, что кончики киноцилии остаются в центре внимания все время. Чтобы получить одно плоскостные изображения, выберите стимул для доставки во время 80 кадров приобретения, после кадра 30, на 3 секунды. Для измерения механочувствительных реакций кальция сосредоточьтесь на основании апических пучков волос и начните приобретение изображений.
Для измерения пресинаптических реакций кальция сосредоточьтесь на основании волосковых клеток и начните приобретение изображений. Шаги, чтобы визуализировать spatiotemporal изменения в интенсивности GCaMP6S, в нейромаст во время моделирования, изложены здесь. Время представлено слева направо в соответствии с штампом времени.
В верхнем ряду показаны пять из четырнадцати временных ячеек из 70-кадровой последовательности изображений GCaMP6S F. Во втором ряду базовый уровень был удален с каждого изображения GCaMP6S F для создания изображений дельты F. В третьем ряду изображения дельты F были преобразованы из серой шкалы в красную горячую таблицу осмотра.
В нижнем ряду третий ряд был наложен на изображения F в верхнем ряду. При попытке этой процедуры важно помнить, чтобы личинка была закреплена правильно, и использовать соответствующие элементы управления, как описано в рукописи, чтобы исключить артефакты движения из ваших данных. Работа с альфа-бунгаротоксином может быть опасной.
Важно принимать меры предосторожности, такие как ношение перчаток при обращении с ним.
