פרוטוקול זה מסייע בחקירת תפקידם של תאי החיסון באיברים מסוימים בבריאות ובפתולוגיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי זוהי טכניקה חסכונית שכן היא טכניקה ידנית. הדגמת ההליך תהיה Zhengkang לואו, דוקטורנט מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל, מניחים את בלוטות התימית והטחול מעכברים שהומות בעבר לתוך 20 מיליליטר phials scintillation, או 15 מ"ל צינורות חרוטיים, מלא 5 מ"ל של תווי מלח מאוזנים של האנק. מניחים את בלוטות הלימפה ניקוז הלבלב לתוך 1.5 מ"ל מיקרו צינורות מלא 1 מ"ל של RPMI-1640. הקפד להשתמש בכל התימוס והטחול, ובכל מחשבי ה- PDLNs.
שמור את האיברים על קרח לאורך כל ההליך. באמצעות זוג מספריים, לסחוט ביסודיות את התימוס והטחול כדי לשחרר את התאים החיסוניים. השלך את שאר הכמוסות התימוסיות והטחולות.
מעבירים את ההשעיה התא לצינור חרוט 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 433 פעמים g וב 4 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולהשליך את supernatant. כדי לתפור את תאי הדם האדומים, להשעות מחדש את ההשעיה התא ב 5 מ"ל של 0.2 כלוריד אמוניום מולאר, דגירה בטמפרטורת החדר במשך עשר דקות.
להפוך את הצינורות בעדינות כל שתי דקות. בסוף הדגירה, מוסיפים 5 מ"ל של HBSS כדי לעצור את התסיסה. צנטריפוגה הצינורות ב 433 פעמים g וב 4 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את התאים בכ- 5 מ"ל של HBSS. לאחר מכן, למלא את הצינורות עם HBSS. חזור על תהליך זה, מ צנטריפוגה הדגימות למילוי הצינור עם HBSS, פעם אחת.
צנטריפוגה הצינורות שוב ב 433 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי, והשהה מחדש את גלולת הכדור ב- HBSS. השג צינורות עגולים תחתונים 5 מ"ל עם כובעי מסננת תאים.
העברה 1 מ"ל של ההשעיה תא התימית ו 500 microlitres של ההשעיה תא הטחול על הצינורות על ידי החלת ההשעיה על כובעי מאמץ התא. ראשית, מניחים צינור חרוט 15 מ"ל לתוך מתלה. מניחים רשת מתכת סטרילית 250 מיקרומטר מעל הצינור.
שוטפים את רשת שינוי עם 1 מ"ל של RPMI. לאחר מכן, להעביר את בלוטות הלימפה רשת מתכת ולהשתמש זוג פינצטה לטחון אותם דרך רשת. החל 1 מ"ל של RPMI על רשת שינוי כדי לשטוף את התאים לתוך הצינור.
חזור על תהליך זה של העברה ושחזה בלוטות הלימפה שלוש פעמים עבור כל מדגם, ולאחר מכן להסיר את רשת. צנטריפוגה הצינורות ב 433 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את התאים בכ- 5 מ"ל של RPMI.
לאחר מכן, למלא את הצינורות עם RPMI. חזור על תהליך זה, מ צנטריפוגה הדגימות למילוי הצינור עם RPMI, פעם אחת. צנטריפוגה הצינורות שוב ב 433 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את גלולת התא ב-2 מ"ל של RPMI. מעבירים 2 מ"ל של ההשעיה התא לתוך 5 מ"ל צינורות עגולים תחתונים עם כובעים מסננת תא. ראשית, צנטריפוגה ההשעיה התא מן התימוס, טחול ו PDLN דגימות ב 433 פעמים g ו ב 4 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
השלך את העל-טבעי. הכתם את התאים בנוגדני פני השטח כמתואר בפרוטוקול הטקסט, והמדגר את הצינורות על הקרח במשך 40 דקות. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטרים של מאגר FACS לכל צינור.
צנטריפוגה ב 433 פעמים g ו בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולהשליך את supernatant. חזור על תהליך זה, הוספת המאגר, צנטריפוגה ומחילה של העל-טבעי, פעם אחת. להשעות מחדש את גלולת התא ב 500 microliters של מאגר קיבוע חדירה כדי לתקן ולחלחל את התאים.
מעבירים את הצינורות למקרר ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, צנטריפוגה הצינורות ב 433 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי, והשהה מחדש את גלולת התא ב-500 מיקרוליטרים של חיץ כביסה חדיר.
צנטריפוגה התאים שוב ב 433 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant. הכתם את התאים בנוגדנים תאיים, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. דגירה הצינורות על קרח במשך שעה אחת.
לאחר מכן, להוסיף 500 microliters של חיץ כביסה permeabilization לכל צינור. צנטריפוגה ב 433 פעמים g ו בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השליכו את העל-טבעי והשעו מחדש את גלולת הכדור ב-500 מיקרוליטרים של חיץ כביסה חדיר.
צנטריפוגה פעם נוספת ב 433 פעמים g ו בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את גלולת התא ב- 300 מיקרוליטרים של מאגר FACS. לאחר מכן, נתח את התאים על ציטרומטר זרימה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
במחקר זה, תאים בודדים מבודדים בלוטות התימית, PDLNs וטחול של עכברי NOD גליקמי נורמלי, והם מוכתמים סמני תא Treg, CD4, CD25, Foxp3, הליוס, ו נוירופילין-1 לניתוח ציטומטרי זרימה. התוצאות מנותחות ומוצגות כאן כאסטרטגיות גת מייצגות. חלקם של תאים חיוביים הליוס בין CD4 חיובי, CD8 שלילי, CD25 חיובי, Foxp3 חיובי Treg תאים נתפסת להיות גבוה יותר מזה של תאים חיוביים Nrp1 בכל שלושת האיברים.
יותר מ 80% של תאי Treg התימוס נראים לבטא הליוס, אשר גבוה יותר מאשר PDLN, ואת הטחול. שיעור התאים החיוביים NrP1 בקרב תאי Treg חיוביים הליוס נראה גבוה יותר PDLN מאשר אלה התימוס או הטחול. רוב תאי ה-Treg החיוביים של Nrp1 מבטאים גם הליוס, ואת שיעור התאים החיוביים הליוס בקרב תאי Treg חיוביים Nrp1 נראה להיות גבוה יותר התימוס והטחול מאשר PDLN.
יחד, תוצאות אלה מצביעות על כך הליוס הוא סמן טוב יותר כדי לזהות תאי Treg מאשר Nrp1. בלוטות הלימפה הם קטנים, אבל כמה סמנים תאיים דורשים מספר רב של תאים כדי לתת אות טוב ציטומטריה זרימה. אין אפשרות לבצע פעולות שירות אחרות לאחר הליך זה מאחר שהתאים כבר מוכתמים ומתים.
אבל ארבעת סמני התאים של החיה יכולים להיות מוחלפים כדי לחקור סוגים אחרים של תאים חיסוניים.
