Bu protokol, bağışıklık hücrelerinin sağlık ve patolojide özellikle organlardaki rolünün araştırılmasına yardımcı olur. Bu tekniğin en büyük avantajı, manuel bir teknik olduğu için bunun uygun maliyetli bir teknik olmasıdır. Prosedürü gösteren Zhengkang Luo, benim laboratuvarımdan doktora öğrencisi olacak.
Başlamak için, daha önce ötenazi olmuş farelerden gelen timik bezleri ve dalakları Hank'in dengeli tuz çözeltisinin 5 ml'si ile doldurulmuş 20 ml sintillasyon phials veya 15 ml konik tüplere yerleştirin. 1 ML RPMI-1640 ml dolu 1,5 ml mikro tüpler içine pankreas drenaj lenf düğümleri yerleştirin. Tüm timus ve dalak ve tüm PDLNs kullandığınızdan emin olun.
Tüm işlem boyunca organları buzda tutun. Makas bir çift kullanarak, iyice bağışıklık hücrelerini serbest bırakmak için timus ve dalak sıkmak. Kalan timik ve dalak kapsülleri atın.
Hücre süspansiyonuna 15 ml konik bir tüp aktarın. Santrifüj 433 kez g ve 4 derece santigrat beş dakika için, ve supernatant atın. Kırmızı kan hücrelerini eşitlemek için hücre süspansiyonunu 0,2 Molar amonyum klorür 5 ml'de yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında on dakika kuluçkaya yatırın.
Tüpleri her iki dakikada bir hafifçe ters çevirin. Kuluçka sonunda, lysis durdurmak için HBSS 5 ml ekleyin. Tüpleri 433 kez g ve 4 derece santigrat derecede beş dakika santrifüj edin.
Supernatant atın ve HBSS yaklaşık 5 ml hücreleri yeniden askıya. Sonra tüpleri HBSS ile doldurun. Numunelerin santrifüjünden tüpün HBSS ile doldurulmasına kadar bu işlemi bir kez tekrarlayın.
Tüpleri bir kez daha 433 kez g ve dört derece santigrat beş dakika santrifüj. Supernatant atın ve HBSS pelet yeniden askıya. Hücre süzgeci kapaklı 5 ml yuvarlak alt tüpler elde edin.
Süspansiyonu hücre süzgeci kapaklarına uygulayarak 1 ml timik hücre süspansiyonu ve 500 mikrolitre dalak hücre süspansiyonunun tüplere aktarılması. İlk olarak, bir raf içine 15 ml konik tüp yerleştirin. Tüpün üzerine steril 250 mikrometrelik metal bir ağ yerleştirin.
1 ml RPMI ile örgü durula. Sonra, metal örgü lenf düğümleri transfer ve örgü onları ezmek için cımbız bir çift kullanın. Hücreleri tüpe yıkamak için kafese 1 ml RPMI uygulayın.
Her örnek için lenf düğümlerini üç kez aktarma ve taşlama bu işlemi tekrarlayın ve sonra örgü kaldırın. Tüpleri 433 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve RPMI yaklaşık 5 ml hücreleri yeniden askıya.
Sonra tüpleri RPMI ile doldurun. Numunelerin santrifüjünden tüpün RPMI ile doldurulmasına kadar bu işlemi bir kez tekrarlayın. Tüpleri tekrar 433 kez g ve dört derece santigrat beş dakika santrifüj.
Supernatant atın ve RPMI 2 ml hücre pelet yeniden askıya. Hücre süspansiyonunun 2 ml'sini hücre süzgeç kapaklı 5 ml yuvarlak alt tüplere aktarın. İlk olarak, timus, dalak ve PDLN örneklerinden hücre süspansiyonuna 433 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin.
Supernatant atın. Hücreleri metin protokolünde belirtildiği gibi yüzey antikorlarıyla lekeleyin ve tüpleri 40 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Ardından, her tüpe 200 mikrolitre FACS arabelleği ekleyin.
Santrifüj 433 kez g ve dört derece santigrat beş dakika için, ve supernatant atın. Arabelleği ekleyerek, santrifüj ekleyerek ve süpernatant'ı bir kez atarak bu işlemi yineleyin. Hücreleri düzeltmek ve permeabilize etmek için 500 mikrolitre permeabilizasyon fiksasyon tamponhücre pelet yeniden askıya.
Tüpleri bir gecede 4 derece santigrat derecede bir buzdolabına aktarın. Ertesi gün tüpleri 433 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve permeabilizasyon yıkama tampon 500 mikrolitre hücre pelet yeniden askıya.
Hücreleri tekrar 433 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin ve süpernatant atın. Metin protokolünde belirtildiği gibi hücreleri hücre içi antikorlarla lekeleyin. Tüpleri 1 saat boyunca buzda kuluçkaya yatırın.
Bundan sonra, her tüp için permeabilizasyon yıkama tampon 500 mikrolitre ekleyin. Santrifüj 433 kez g ve dört derece santigrat beş dakika. Supernatant atın ve permeabilizasyon yıkama tampon 500 mikrolitre pelet yeniden askıya.
Santrifüj bir kez daha 433 kez g ve dört derece santigrat beş dakika. Supernatant atın ve FACS tampon 300 mikrolitre hücre pelet yeniden askıya. Ardından, metin protokolünde belirtildiği gibi, akış sitometresi üzerindeki hücreleri analiz edin.
Bu çalışmada, tek hücreler normal glisemik NOD farelerin timik bezleri, PDLN'ler ve dalaklardan izole edilmiştir ve akış sitometrik analizi için Treg hücre belirteçleri, CD4, CD25, Foxp3, Helios ve nöropilin-1 ile boyanmıştır. Sonuçlar analiz edilir ve burada temsili gating stratejileri olarak gösterilir. CD4-pozitif, CD8-negatif, CD25-pozitif, Foxp3-pozitif Treg hücreleri arasındaki Helios-pozitif hücrelerin oranı nın her üç organdaki Nrp1-pozitif hücrelerden daha yüksek olduğu görülmektedir.
Timusdaki Treg hücrelerinin %80'inden fazlasının PDLN'den daha yüksek olan Helios ve dalak ifade ettiği görülmektedir. Helios-pozitif Treg hücreleri arasında NrP1-pozitif hücrelerin oranı timus veya dalak olanlara göre PDLN daha yüksek olduğu görülmektedir. Nrp1-pozitif Treg hücrelerinin çoğunluğu da Helios ifade, ve Nrp1 pozitif Treg hücreleri arasında Helios-pozitif hücrelerin oranı pdln daha timus ve dalak daha yüksek olduğu görülmektedir.
Birlikte, bu sonuçlar Helios Nrp1. Lenf düğümleri daha T Treg hücreleri tespit etmek için daha iyi bir belirteç olduğunu göstermektedir, ancak bazı hücre içi belirteçleri akış sitometri iyi bir sinyal vermek için hücrelerin çok sayıda gerektirir. Hücreler zaten lekeli ve ölü olduğundan, bu işlemden sonra başka yöntemler yapılamaz.
Ama hayvanın dört hücre belirteci diğer bağışıklık hücrelerini incelemek için değiştirilebilir.
