Questo protocollo aiuta a indagare il ruolo delle cellule immunitarie in particolari organi in salute e patologia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che questa è una tecnica economica poiché è una tecnica manuale. A dimostrare la procedura sarà Zhengkang Luo, dottorando del mio laboratorio.
Per iniziare, posizionare le ghiandole timiche e le milza di topi precedentemente eutanasiati in fiale a scintillazione da 20 ml, o tubi conici da 15 ml, riempiti con 5 ml della soluzione salina bilanciata di Hank. Posizionare i linfonodi drenante pancreatico in micro-tubi da 1,5 ml riempiti con 1 ml di RPMI-1640. Assicurarsi di utilizzare l'intero timo e milza e tutti i PDLN.
Tenere gli organi sul ghiaccio per tutta la procedura. Usando un paio di forbici, spremere accuratamente il timo e la milza per rilasciare le cellule immunitarie. Scartare le restanti capsule timiche e spleniche.
Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 ml. Centrifugare a 433 volte g e a 4 gradi celsius per cinque minuti, e scartare il supernatante. Per liscire i globuli rossi, sospendere di nuovo la sospensione cellulare in 5 ml di cloruro di ammonio molare e incubare a temperatura ambiente per dieci minuti.
Invertire delicatamente i tubi ogni due minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere 5 ml di HBSS per interrompere la lisi. Centrifugare i tubi a 433 volte g e a 4 gradi celsius per cinque minuti.
Scartare il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in circa 5 ml di HBSS. Quindi, riempire i tubi con HBSS. Ripetere questo processo, dalla centrifugazione dei campioni al riempimento del tubo con HBSS, una volta.
Centrifugare i tubi ancora una volta a 433 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in HBSS. Ottenere tubi a fondo tondo da 5 ml con tappi a filtro cellulare.
Trasferire 1 ml della sospensione della cella timica e 500 microlitri della sospensione cellulare splenica ai tubi applicando la sospensione ai tappi del filtro cellulare. Per prima cosa, metti un tubo conico da 15 ml in un rack. Posizionare una rete metallica sterile da 250 micrometri sul tubo.
Risciacquare la rete con 1 ml di RPMI. Successivamente, trasferire i linfonodi sulla rete metallica e utilizzare un paio di pinzette per macinarli attraverso la rete. Applicare 1 ml di RPMI sulla rete per sciacquare le celle nel tubo.
Ripetere questo processo di trasferimento e macinazione dei linfonodi tre volte per ogni campione, quindi rimuovere la rete. Centrifugare i tubi a 433 volte g e a quattro gradi celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in circa 5 ml di RPMI.
Quindi, riempire i tubi con RPMI. Ripetere questo processo, dalla centrifugazione dei campioni al riempimento del tubo con RPMI, una volta. Centrifugare nuovamente i tubi a 433 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet cellulare in 2 ml di RPMI. Trasferire 2 ml della sospensione cellulare in tubi a fondo tondo da 5 ml con tappi a filtro cellulare. In primo luogo, centrifugare la sospensione cellulare dai campioni di timo, milza e PDLN a 433 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Scartare il supernatante. Macchiare le cellule con anticorpi superficiali come delineato nel protocollo di testo e incubare i tubi sul ghiaccio per 40 minuti. Aggiungere quindi 200 microlitri di tampone FACS a ciascun tubo.
Centrifugare a 433 volte g e a quattro gradi celsius per cinque minuti, e scartare il supernatante. Ripetere questo processo, aggiungendo il buffer, centrifugando e scartando il supernatante, una volta. Sospendere di nuovo il pellet cellulare in 500 microlitri di tampone di fissaggio permeabilizzazione per fissare e permeabilizzare le cellule.
Trasferire i tubi in frigorifero a quattro gradi celsius durante la notte. Il giorno dopo, centrifuga i tubi a 433 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet cellulare in 500 microlitri di tampone di lavaggio permeabilizzazione.
Centrifugare nuovamente le cellule a 433 volte g e a quattro gradi celsius per cinque minuti e scartare il supernatante. Macchiare le cellule con anticorpi intracellulari, come delineato nel protocollo di testo. Incubare i tubi sul ghiaccio per 1 ora.
Successivamente, aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio permeabilizzazione a ciascun tubo. Centrifuga a 433 volte g e a quattro gradi celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in 500 microlitri di tampone di lavaggio permeabilizzazione.
Centrifuga ancora una volta a 433 volte g e a quattro gradi celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet cellulare in 300 microlitri di tampone FACS. Quindi, analizzare le celle su un citometro di flusso, come descritto nel protocollo di testo.
In questo studio, le singole cellule sono isolate da ghiandole timemiche, PDLN e milza di normali topi NOD glicemici, e sono macchiate con marcatori cellulari Treg, CD4, CD25, Foxp3, Helios e neuropilina-1 per l'analisi citometrica del flusso. I risultati vengono analizzati e qui vengono mostrati come strategie rappresentative di gating. La proporzione di cellule elios-positive tra le cellule Treg cd4 positive, CD8-negative, CD25-positive, Foxp3-positive è vista come superiore a quella delle cellule Nrp1-positive in tutti e tre gli organi.
Più dell'80% delle cellule di Treg nel timo sono viste esprimere Helios, che è più alto che nel PDLN, e la milza. La proporzione di cellule NrP1-positive tra le cellule Treg elios-positive è considerata più alta nel PDLN rispetto a quelle nel timo o nella milza. La maggior parte delle cellule treg positive nrp1 esprimono anche Helios, e la proporzione di cellule elios-positive tra le cellule Treg positive Nrp1 è vista come più alta nel timo e nella milza che nel PDLN.
Insieme, questi risultati indicano che Helios è un marcatore migliore per rilevare le cellule T Treg rispetto a Nrp1. I linfonodi sono piccoli, ma alcuni marcatori intracellulari richiedono un gran numero di cellule per dare un buon segnale nella citometria del flusso. Altri metodi non possono essere eseguiti dopo questa procedura perché le celle sono già macchiate e morte.
Ma i quattro marcatori cellulari dell'animale possono essere sostituiti per studiare altri tipi di cellule immunitarie.
