אסטרטגיות רגישות אלה ניתן להשתמש כדי להעריך את יעילות עיכוב של מעכבים כימיים בשילוב עם מחיקת גנים CRISPR-Cas9 כדי לחקור את מטרות התרופה. במקום להשתמש בהקדשה נקודת קצה, צמיחת טפילים יכולה להיות מנוטרת לאורך זמן כדי לאפשר חישוב של זמן הכפלת טפיל באמצעות חלבון כתב רגיש. בדיקה זו יכולה להיות קנה מידה עד 384 או 1, 536 microplates היטב לבדיקה של תרכובות מרובות או להקרנה של ספריות באופן תפוקה גבוהה.
אסטרטגיה זו ניתן לשנות כדי לכמת את הצמיחה של פתוגנים מיקרוביאליים תאיים אחרים ואת התגובות שלהם לתרופה של עניין. כדי לבצע בדיקה לצמיחה Toxoplasma מבוסס לוציפראז, להתחיל על ידי שאיפה בזהירות המדיום מן תרבויות microplate מראש 96 היטב של fibroblasts העורלה האנושית לחסן 150 microliters של השעיית טפיל B לתוך הבארים בפורמט שלוש עמודה וחמש שורה. לאחר אינקובציה של ארבע שעות באינקובטור תרבות התא, בזהירות שאפו את המדיום מכל באר כדי להסיר את הטפילים שאינם פלשו ולמלא את הבארים בכל אחד מלבד השורה הראשונה עם טמפרטורת החדר פנול אדום חינם מדיום.
לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של פתרון מצע לוציפראז מיקרומולרי 12.5 ב- PBS לכל באר של השורה העליונה והדקירה את המיקרופלאטים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר תות תא מלא. בסוף הדגירה, למדוד את פעילות luciferase על קורא מיקרופלסטיק. כל קריאה מייצגת את המספר הראשוני של טפילים פלשו בארבע שעות לאחר ההדבקה.
חזור על הניתוח כל 24 שעות במשך ארבעת הימים הבאים מבלי לשנות את המדיום. כדי לחשב את השינוי המנורמל של צמיחת טפילים, כל קריאה יכולה להיות מחולקת על ידי הקריאה הראשונית בארבע שעות לאחר ההדבקה. יומן 2 של קיפול-שינוי מנורמל של צמיחת טפילים אז יכול להיות התווה נגד כל נקודת זמן נתון פונקציית רגרסיה ליניארית כדי להשיג את השיפוע המייצג את זמן ההכפלה.
כדי להעריך את היעילות של עיכוב של תרכובת של עניין על צמיחת Toxoplasma, תרבות סיבי העורלה האנושית ב 96-גם microplates לפחות שבעה ימים לפני חיסון כל באר של תאים עם 150 microliters של טפילים כפי שהוכח במשך ארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. במהלך הדגירה, להכין את המתחם של ריבית בשמונה ריכוזים שונים במאגר 12 באר על ידי דילול סדרתי. מדללים את התרכובות במאגר של 12 באר בדילול של 1-3 על ידי צינורות כל תערובת למעלה ולמטה מספר פעמים עם פיפיטר מיליליטר אחד.
בארבע שעות לאחר ההדבקה, החלף את המדיום בכל באר מעמודים 2 עד 9 עם 150 microliters של בינוני בתוספת כל דילול של המתחם, משאיר את העמודה הראשונה מלא בינוני רגיל לשמש שליטה שאינה מטופלת. לאחר מכן להחזיר את תרבות התאים לאנקובטור תרבות התא במשך 96 שעות ולמדוד את פעילות luciferase עבור כל באר כדי לקבוע את אחוז עיכוב הצמיחה בתרבויות בכל ריכוז של מתחם. כדי לחשב את פעילות לוציפראז מנורמל כאחוז, לחלק את פעילות luciferase הממוצע עבור כל ריכוז מורכב על ידי פעילות luciferase הממוצע נגזר טפילים שאינם מטופלים.
לאחר מכן השתמש בתוכנת גרפים מתאימה כדי להתוות את פעילויות luciferase מנורמל נגד המתחם הבודד כדי לחשב את הריכוז מעכבות חצי מקסימלי עבור כל תרכובת. כדי ליצור מבנה פלסמיד המבטא RNA חד-מדריך ו- Cas9 למחיקת גן מעניין, נווט אל דף המשאבים הגנומיים של Toxoplasma ואחזר את רצף קידוד הגנים כולו כולל האינטרונים והאקסונים יחד עם 1.5 קילו-באז חמישה ושלושה אזורים עיקריים שאינם מיועדים. העתק את רצף TgCPL שאוחזר לתוכנה לניתוח רצף ותייג את חמשת ושלושת האזורים הלא מתורגמים.
בדף משאב טוקסופלזמה גנומיקה, לחץ על הורד, קבצי נתונים Current_Release. בתיקיה T.gondii GT1, בחר FASTA. מתקיית הנתונים, הורד את קובץ רצף הגנום של זן Toxoplasma gondii GT1.
לאחר מכן צור תיקיה מקומית בשם Toxoplasma Genome בתוכנת ניתוח רצף ה- DNA וייבא את קובץ רצף הגנום של Toxoplasma לתיקיה. בחר כלים, שיבוט ולמצוא אתרי CRISPR והגדר שלושה ראשי Cas9 ראשוני עבור מיקום אתר PAM. בחר RNA עם קו מנחה יחיד המדגים ציון ספציפיות גבוה, בדרך כלל גדול מ- 98%וחסר G לאחר NGG.
ה- RNA החד-מדריך שנבחר ממוקם בדרך כלל באתרים הקרובים להתחלה ולעצור קודונים של גן העניין. לאחר מכן השתמש בקדם-מיקס PCR עם ההגדרות כפי שצוין בטבלה כדי לבצע תגובת PCR כדי לשנות את הפלסמיד המתקדם המבטא RNA חד-מדריך שמטרתו הגן TgUPRT. עבור Transfection Toxoplasma, לערבב שני מיקרוגרם של DNA תבנית מתוקנת עם 20 מיקרוגרם של פלסמיד ביטוי RNA Cas9 מדריך יחיד ומערבבים 400 microliters של resuspension טפיל, DNA, וחמישה microliters של 200 מילימולאר ATP 500 מילימולרית מופחת גלוטתיון בצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר.
הוסף חיץ ציטומיקס כדי להביא את הנפח הכולל עד 500 microliters לפי הצורך ולהעביר את תערובת DNA טפיל לפער של ארבעה מילימטר עם קולט אלקטרופורציה. ואז אלקטרופולאט הטפילים בשני קילו-וולט ו-50 אוהם של התנגדות. כדי לשכפל טפילי נוקאאוט, בצע תחילה דילול דו-שלבי של הטפילים כדי להשיג 10 טפילים למיליליטר של מדיום D10 בתוספת הריכוז האנטיביוטי המתאים.
לאחר מכן, מעבירים 150 מיקרוליטרים של הטפילים המטוהרים המתווסכלים מחדש לכל באר של מיקרופלסטיק 96 בארות עם פיברובלסטים מעורלה ודגירה של המיקרופלסטיק ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך שבעה ימים. בסוף הדגירה, לזהות את בארות המכילות לוחית אחת ולהעביר 75 microliters של toxoplasma נגוע טוקסופלזמה פיברובלסטים אנושיים מכל באר של תרבות מיקרופלסטיק 96 היטב לתוך צינורות בודדים 1.5 מיליליטר. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה resuspend כדורי ב 10.25 microliters של מאגר תמוגה המכיל מאגר דילול תוסף שחרור DNA.
לאחר מכן להדגיר את הדגימות במשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר ושתי דקות ב 98 מעלות צלזיוס לפני ביצוע PCR כדי לבדוק את השילוב של קלטת ההתנגדות לסמים ואובדן הגן של עניין. יעילות העיכוב של LHVS וסוג פראי בזני CPL דלתא ניתן לקבוע על ידי התוויית פעילות luciferase שלהם נגד ריכוזי מעכבים שונים. לאחר PCR, הפלסמיד שעבר מוטציה הוא ליניארי וטעון לתוך ג'ל 1%agarose לאימות הגברה מוצלחת.
לאחר מיצוי ג'ל וטרנספורמציה E.coli, שיבוטים המכילים את הפלסמידים הצפויים ניתן לסנן על ידי הגבלת עיכול אנדונוקלאז ברצף DNA. לאחר הגברה תבנית תיקון, אלקטרופורזה ג'ל agarose ניתן להשתמש כדי לאמת את הגודל הנכון של מוצר PCR. בדרך כלל, שבעה עד שמונה שיבוטים נבחרים להקרנה הראשונית כדי לבדוק את מחיקת רצף הקידוד של גן העניין, ואחריו זיהוי של חמש ושלוש הזרועות העיקריות כדי לעזור להפחית את המספר הכולל של שיבוטים להיות מוקרן.
אימות נוסף יכול להסתיים על ידי immunoblotting אם כל נוגדן מזהה את חלבון היעד זמין. לפני קבלת מדידות פעילות לוציפראז, microplate ברור עם זיהום מדומה צריך להיבדק תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח כי הטפילים לא באופן מלא lyse התאים המארחים.
