שיטה זו ענתה על שאלות מפתח בתחום, כגון כיצד ליצור מודל עכבר כימרי כבד אנושי, היפרכולסטרולמיה משפחתית. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא שהיא מאפשרת ביצוע בדיקות סמים ב vivo. טכניקה זו יש סינדיקציה לטיפולים של היפרכולסטרולמיה משפחתיים.
כטיפול חדש למחלה זו, זה יכול להיבדק באמצעות מודלים כאלה בעלי חיים כימריים. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה על היפרכולסטרולמיה משפחתיים, זה יכול להיות מיושם גם על מחלות כבד תורשתיות אחרות. 24 שעות לפני חריטה, להפשיר 40 microliters של מטריצה חוץ תאית לכל עכבר, על ידי הצבת בתיבת קרח, בחדר קר.
מצננים מזרק אינסולין לכל עכבר להזרקה ותיבה של 200 טיפים מיקרוליטר במקרר של ארבע מעלות צלזיוס. שעה לפני חריטה, לחמם את האנזים דיסוציאציה התא, בתוספת 50 מיקרוגרם למיליליטר של DNAase 1, לטמפרטורת החדר ולהמקם RPMI 1640 בינוני, בתוספת 20 אחוז החלפת סרום על קרח. קח תמונות ניגודיות פאזה של iHeps כדי לתעד את מצבם, כולל מורפולוגיה של תאים, צמיחה וצפיפות תאים.
לאחר מכן, לשטוף כל באר של iHeps עם 2 מיליליטר של סידן בטמפרטורת החדר PBS ללא מגנזיום יונים פעמיים ולאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של אנזים דיסוציאציה התא מחומם מראש לכל באר. מחזירים את התאים לאנקובטור למשך 8 עד 10 דקות. לפקח על מורפולוגיה התא תחת המיקרוסקופ.
כאשר רוב התאים הופכים עגולים, מוסיפים נפח שווה של מדיום קר ל הבאר, פיפטה התאים בעדינות כדי להתנתק מהצלחת, ולהעביר את ההשעיה התא לצינור חדש 15 מיליליטר. צעד זה הוא קריטי לאמינות hepatocytes. אם קשה לנתק את התאים מהצלחת, ניתן להשאיר חלקם על הצלחת.
ואם התאים מתנתחים, אז פיפטה בעדינות לאחר צנטריפוגה, כדי לקבל השעיה של תא יחיד. חזור על הליך ניתוק התאים עבור כל באר עד שכמעט כל התאים המצורפים נאספים. ואז צנטריפוגה ב 200 גרם במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant מחדש להשעות את התאים עם שני מיליליטר של PBS קר בצינור 15 מיליליטר. פיפטה התאים בעדינות כדי לקבל השעיה של תא יחיד. לאחר מכן, להעביר את התאים דרך מסננת תא 40 מיקרון כדי להסיר אגרגטים.
בדרך כלל, אחד עד שני מיליון תאים על ניתן לקצור לאחר כמה ter-ing. לאחר מכן, להוסיף microliters של 0.4 אחוז פתרון כחול Trypan ל 20 microliters של השעיית תא. לספור את התאים ולתרשם את הריכוז של השעיית התא כמו C.לחשב את הנפח הנדרש של השעיית תא להזריק מיליון תאים לכל עכבר.
לאחר מכן להקצות את הנפח הנדרש של השעיית התא לתוך 15 צינורות מיליליטר צנטריפוגה ב 200 גרם במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסרת supernatant, להשעות מחדש את התאים 27.5 microliters של PBS קר לכל עכבר. ולאחר מכן הוסף נפח שווה של מטריצה חוץ-תאית לנפח סופי של 55 מיקרוליטרים לעכבר.
עכשיו, שים את אחד מזרקי האינסולין הקרים על קרח. נתק את הבוכנה, העבר 55 מיקרוליטרים של השעיית תא למזרק ולאחר מכן להחזיר את הבוכנה. פריקה בועות בזהירות, ולשים את המזרק בחזרה על קרח.
ודא כי עכברי LRG הם הרדמה כראוי לפני תחילת הליך ההזרקה. יש למרוח משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש במהלך הליך ההרדמה. לאחר שהעכבר איבד את רפלקס השריר לגירוי, מניחים אותו במצב הנכון, בצד, דטוביטוס.
החל שכבה עבה של קרם depilatory לאזור החתך באגף השמאלי, ולהשאיר במשך חמש עד שמונה דקות. הסר את קרם depilatory ושיער על ידי ניגוב האזור עם כרית גזה לחה במים. לשפשף את האגף השמאלי עם 70 אחוז אתנול שלוש פעמים.
לאחר מכן לאתר את הטחול, אשר ניתן לראות באגף השמאלי. ואחריו השרייה סופית עם בטדין לחיטוי. לאחר שימוש במספריים כדי לבצע חתך של 0.5 עד 1 ס"מ בעור ובקיר הבטן, השתמש במקלפים כדי להפוך את הטחול החוצה על ידי משיכה עדין של רקמת השומן שמסביב.
מייצבים בעדינות את הטחול בעזרת ספוגית. הכנס את המחט של מזרק האינסולין שלושה עד ארבעה מילימטרים לתוך parenchyma של הטחול, בעדינות להזריק כ 50 microliters של השעיית התא. לסגת המחט ולה מניחים צמר גפן על הזריקה במשך דקה אחת כדי למנוע דימום ושפיכת חומר.
תחזיר את הטחול לנקבה, ותסגור את הפצע עם תפרים של חמישה ניילון. לאחר הת תפר, מניחים את העכבר בכלוב נקי עם גישה נוחה למזון ומים. התחל על ידי הסרת האיברים הפנימיים מהעכבר המתת דם טרי, כך בית המשפט היורד, במקביל לעמוד השדרה, גלוי.
ואז לנתח את הרקמה הסמוכה, ולהסיר את הלב. השתמש במספריים עדין כדי לנתח את אב-האונים, ולהכניס כל אחד מהם לתספורת קרבס קרה מחומצנת. לאחר האיסוף, מעבירים את אב-הבית בפתרון קרבס לצלחת פטרי מצופה סיליקון.
הצמד את רקמת החיבור כדי לתקן את מיקום העורקים מבלי למתוח אותו. תחת מיקרוסקופ סטרילי, השתמש במקלפים עדין ומספריים באביב כדי לנתח את העורקים ללא רקמת השומן וההרפתקאות שמסביב מבלי לפגוע בקיר הכלי. ואז לחתוך כל ביתא לתוך אחד וחצי עד שני מקטעים באורך מילימטר.
לאחר מכן, חותכים חתיכה באורך שני סנטימטרים של חוט אל-חלד בעובי 40 מיקרון, ומכניסים בעדינות לתוך לומן ביתא. החזק את החוט כדי להעביר את הקטע לתא מיוגרף התיל, מלא בתתא קרבס מחומצן. כדי למדוד את אורך מקטעי ביתא כאשר לומדים התכווצות, מקם כל מקטע בניצב בין הלסתות, והקליט את קריאת D1 על המיקרומטר.
ואז להסיר את הקטע ולהזיז את הלסתות יחד. רשום את קריאת D0 וחשב את אורך המקטע. לאחר מכן, מהדקים את החוט ומאבטחים אותו באמצעות המברג תוך הצבת המקטע הבלתי מרוסן בין הלסתות.
לנורמליזציה לפני הניסוי, הגדר את ההישום לאפס במצב לא מרוכך. ואז לאט לאט להזיז את הלסתות לגזרים ולהתבונן שינוי מתח ביתא עד שהגיע לשלושה מילינוטון. לאחר 15 דקות, לנקז את הפתרון מן תא מיוגרף ולהחליף עם פתרון קרבס טרי.
לאחר המתנה של 15 דקות נוספות, שוב להתאים את המתח לשלושה מילינוטון. לאחר מכן לשנות את הפתרון קרבס סטנדרטי פתרון קרבס בתוספת 60 מילימולר אשלגן כלורי, כדי לגרום התכווצות לפחות רבע שעה. יש לשטוף עם פתרון קרבס טרי שלוש פעמים, ולאחר מכן להוסיף ריכוזים הולכים וגדלים של פנילפירין.
לדוגמה, 10 ננומולרים עד 100 מיקרומולרים. לאחר מכן, לאחר שטיפה עם פתרון קרבס סטנדרטי, להוסיף ריכוז אחד של פנילפירין, על 70 אחוז של התכווצות מקסימלית. כאשר ההתכווצות יציבה, מוסיפים ריכוזים הולכים וגדלים של אצטילכולין במרווחים של שתי דקות.
לדוגמה, 1-3 ננו-מיליאר עד עשר עד שלושים מיקרו-מיליאר כדי לגרום לוודילציה. תמונה זו מציגה תמונה סרוקה של קטע שלם מייצג של כתמי אלבומין אנושיים בכבד עכבר מאוכלס מחדש עם iHeps קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה. חצים מצביעים על אשכולות של iHeps אנושיים חריט לתוך הכבד העכבר.
האשכולות של iHeps אנושיים חרוטים נראים בפירוט רב יותר כאן. גרף פיזור זה מציג את אחוז התאים החיוביים של אלבומין אנושי מאוכלסים מחדש המתאימים ל- iHep המכילים אזורים בכבד העכבר, מ- iPSCs תורמים שונים. זוהי תמונה מייצגת של כתמים אימונוהיסטוכימיים עבור גרעינים אנושיים בכבד עכבר, עם היפרכולסטרולמיה משפחתית חטובה iHeps.
גרף הבר מראה את אחוז ה-iHeps החיוביים של הגרעינים האנושיים המאכלסים מחדש מ- iPSCs תורמים שונים בכבדי עכבר LRG. אלה תמונות מייצגות של אלבומין אנושי וכתמי גרעינים אנושיים על שני חלקים רצופים של כבד עכבר, מאוכלסים מחדש עם iHeps מסוג פראי. לבסוף, תמונה זו מראה vasodilation תלוי אנדותל של בית הדם בעכברים היפרכולסטרולמיה אנושית בכבד משפחתי, בתגובה לריכוזים הולכים וגדלים של אצטילכולין.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך ליצור עכברים כימריים כבד אנושי, באמצעות hepatocytes נגזר iPSC אנושי.
