Bu yöntem, yüksek saflıkta insan karaciğer tomurcuk ataları ve hepatosit benzeri hücrelerin çok sayıda nesil sağlar. Yeteneği bu karaciğer hücreleri oluşturmak için rejeneratif tıp ve diğer alanlar için önemli olabilir. Karaciğer farklılaşmasını teşvik etmek ve istenmeyen hücre tiplerinin oluşumunu bastırmak için gelişimsel sinyal yollarını kontrol ederek, bu yöntem insan karaciğer tomurcuk ataları ve hepatosit benzeri hücrelerin verimli bir şekilde altı ve 18 gün farklılaşma ile lenmesini sağlar.
Bu tekniğin en büyük avantajı üretilen insan karaciğer hücrelerinin yüksek saflıkta olmasıdır. Bu yordam olmak için, bir karıştırma çubuğu içeren konik bir şişe için IMDM 50 mililitre ekleyin. Orta sıcaklığı 50 dereceye ısıtın ve mililitre başına 10 miligram konsantrasyonda pva stoku hazırlamak için sürekli karıştırarak 0,5 gram PVA ekleyin.
Bundan sonra, PVA çözeltisini ısıtma yastığından çıkarın ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Çözelti soğuduktan sonra steril, 0,2 mikrometrefiltreden geçirin. Filtre uygulanmış PVA'yı metin protokolünden birinci tabloda belirtildiği gibi diğer reaktiflerle birleştirerek CDM2 ve CDM3'ü hazırlayın.
Tüm ortamları filtrelemek için steril, 0,2 mikrometre filtre kullanın. Ardından, metin protokolünün tablo birinci tablosunda belirtildiği gibi kalan temel ortamı, CDM4 ve CDM5'i hazırlayın. Farklılaşma ortamını hazırlamak için önce donmuş küçük molekülleri ve/veya büyüme faktörlerini oda sıcaklığında eritin.
Aliquot gerekli miktarda baz orta dışarı ve uygun konsantrasyonlarda baz orta belirtilen küçük moleküller ve büyüme faktörleri ekleyin. Kullanımdan bir gün önce matrisi dört santigrat derecede eritin. Ertesi gün, 50 mililitre soğuk DMEM'e 500 mikrolitre matris ekleyerek matrisi 1'den 100'e kadar seyreltin.
Pipet kuyu yüzeyini kapsayacak kadar çözelti hacmi kullanarak kuyuların gerekli sayıda içine seyreltilmiş matris. Matris kaplı plakayı en az 60 dakika boyunca 37 derecede bir kuvöze aktarın. Tohumlamadan hemen önce, kaplamalı kuyulardan kalan matris çözeltisini aspire edin.
Daha sonra, büyük ölçüde confluent hPSC kültür plakası orta aspire ve ticari olarak satın ayrışma ajanı ekleyin, hücrelerin büyümekte olduğu yüzeyi kapsayacak kadar kullandığınızdan emin olun. Ayrıştırma ajanındaki hPSC'leri 5 dakika veya bazı koloniler ayrışmaya başlayana kadar 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ardından, dissosiasyon aracısını seyreltmek için DMEM ve F-12 ekleyin.
Kuyunun yüzeyindeki tüm hücreleri yıkamak için yavaşça yukarı ve aşağı birden çok kez pipet için beş mililitrelik serolojik pipet kullanın. 50 mililitrelik konik bir tüp içinde resuspended tek hücreleri toplamak ve gerektiğinde DMEM ve F-12 ile seyreltin. 350 kez g ve dört derece santigrat üç dakika boyunca hücreleri pelet toplanan hPSCs bu tüp santrifüj.
Santrifüj beklerken, hPSC'lerin tohumlaşacağı plakadan matrisi aspire edin. Alıcı kuyularına bunları kapsayacak kadar yeterli miktarda mTeSR ortam ekleyin. Santrifüj tamamlandığında, konik tüpün altında peletli hPSC'ler bırakarak, dikkatle supernatant aspire.
MTeSR hücre pelet resuspend ticari elde Tiyazzovivin bir mikromolar ile takviye. P1000 pipet kullanarak, hücre peletini tek bir hücre süspansiyonuna eşit olarak yeniden askıya almak için 2-3 kez hafifçe triturate. Hemen pipet 10 mikrolitre hücre süspansiyonu hemositometreye ve hücre sayısını sayar.
Kaplama için istenilen hücre konsantrasyonuna ulaşmak için Thiazovivin destekli mTeSR ile yeniden askıya alınan hPSC'lerin hacmini ayarlayın. Daha sonra, hücrelerin eşit olarak dağıtıldıkemin için bir çapraz desen plaka birkaç kez sallayın. HPSC'ler en az 24 saat boyunca kaplandıktan sonra, kaplanmış hPSC kolonilerinin çapına özel önem vererek hücrelerin morfolojisini kontrol etmek için faz kontrastmikroskobu kullanın.
Ardından, metin protokolünün ikinci tablosunda belirtildiği gibi, birinci gün APS farklılaştırma ortamını hazırlayın. Tohumlamadan bir gün sonra, kaplamalı hPSC'lerden Thiazovivin destekli mTeSR'yi aspire edin ve kısaca IMDM ortamla yıkayın. Bundan sonra, hPSCs için gün bir orta ekleyin.
Zamanı kaydedin ve hücreleri 37 derecede kuvöze geri yerleştirin. Gerekli farklılaşma ortamını hazırlayarak ve günün aynı saatinde farklılaşmanın ilgili günlerinde hücrelere ekleyerek sonraki farklılaşma adımlarına devam edin. Bu çalışmada, karaciğer tomurcuk atalarının zenginleştirilmiş popülasyonları ve daha sonra hepatosit benzeri hücreler hPSC'lerden üretilmiştir.
Farklılaşmanın ikinci gününde, ilkel çizgi hücreleri ikinci güne kesin endoderm hücrelerine farklılaşmıştır. Bu hücrelerin büyük çoğunluğu SOX17 ve FOXA2 ifade. Diferansiyasyonun üçüncü gününde, endoderm hücreleri çokgen şeklinde görünen foregut atalarına dönüşmüştür.
Daha sonra, altıncı gün, foregut ataları karaciğer tomurcuk ataları içine farklılaşmış. Bu karaciğer tomurcuk ataları AFP ifade, TPX3, ve HNF4alpha. Üç hPSC hatları arasında, Bu yöntem yaklaşık% 89 bir verimlilikle gün altı AFP-pozitif karaciğer ataları oluşturur Son olarak, hPSCs karaciğer farklılaşması 18 gün sonra, albumin-pozitif hepatosit benzeri hücreler görünür.
Morfolojik olarak, bu hücreler epitel görünür, safra canaliculi anımsatan parlak sınırları oluşturan. Bu aşamada, günün sitoplazması 18 hPSC kaynaklı hepatositler çekirdekten daha koyu görünür. Diferansiye için insan pluripotent kök hücreleri tohumlama zaman, doğru yoğunlukta tohum ve aynı zamanda plaka sallayarak kuyu boyunca dağıtmak için zorunludur.
İnsan hepatositleri in vitro üretme yeteneği, bilim adamlarının karaciğer gelişiminin altında yatan mekanizmaları araştırmalarına olanak tanıyan bir teknolojidir. Bu yöntem, karaciğer fonksiyon unu ve hastalığı araştırmak ve sonunda karaciğer yetmezliği için yeni tedaviler sağlamak için kullanılabilecek in vitro insan hepatositleri çok sayıda üretir.
