Cette méthode permet la génération d’un grand nombre d’progéniteurs de bourgeons hépatiques humains et de cellules hépatocytes d’une grande pureté. La capacité de générer ces cellules hépatiques pourrait être importante pour la médecine régénérative et d’autres domaines. En contrôlant les voies de signalisation développementales pour favoriser la différenciation hépatique et supprimer la formation de types de cellules indésirables, cette méthode permet une génération efficace d’progéniteurs de bourgeons hépatiques humains et de cellules de type hépatocyte par six et 18 jours de différenciation respectivement.
Le principal avantage de cette technique est la grande pureté des cellules hépatiques humaines générées. Pour être cette procédure, ajouter 50 millilitres d’IMDM à un flacon conique contenant une barre d’agitation. Chauffer le milieu à 50 degrés Celsius et ajouter 0,5 gramme de PVA tout en remuant continuellement pour préparer un stock de PVA à une concentration de 10 milligrammes par millilitre.
Après cela, retirez la solution PVA du coussin chauffant et laissez-la refroidir à température ambiante. Une fois la solution refroidie, filtrez-la à travers un filtre stérile de 0,2 micromètre. Préparer le CDM2 et le CDM3 en combinant l’AAC filtrée avec d’autres réaccés tel qu’il est décrit dans le tableau un du protocole textuel.
Utilisez un filtre stérile de 0,2 micromètre pour filtrer tous les supports. Ensuite, préparez les autres médias de base, CDM4 et CDM5, tels qu’ils sont décrits dans le tableau un du protocole du texte. Pour préparer le milieu de différenciation, décongelez d’abord les petites molécules congelées et/ou les facteurs de croissance à température ambiante.
Aliquot la quantité requise de milieu de base et ajouter les petites molécules spécifiées et les facteurs de croissance au milieu de base aux concentrations appropriées. La veille de l’utilisation, décongeler la matrice à quatre degrés Celsius. Le lendemain, diluer la matrice à un rapport de un à 100 en ajoutant 500 microlitres de matrice en 50 millilitres de DMEM froid.
Pipette la matrice diluée dans le nombre requis de puits en utilisant juste assez de volume de solution pour couvrir la surface du puits. Transférer la plaque enduite de matrice dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant au moins 60 minutes. Immédiatement avant l’ensemencement, aspirez la solution matricielle restante des puits enduits.
Ensuite, aspirez le milieu à partir d’une plaque de culture hPSC largement confluente et ajoutez un agent de dissociation acheté commercialement, en vous assurant d’utiliser juste assez pour couvrir la surface sur laquelle les cellules se développent. Incuber les hPSCs dans l’agent de dissociation à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes ou jusqu’à ce que certaines colonies commencent à se détacher. Ensuite, ajoutez DMEM et F-12 pour diluer l’agent de dissociation.
Utilisez une pipette sérologique de cinq millilitres pour pipette doucement de haut en bas plusieurs fois pour laver toutes les cellules de la surface du puits. Recueillir les cellules individuelles résuspendues dans un tube conique de 50 millilitres et diluer avec DMEM et F-12 au besoin. Centrifugeuse ce tube de hPSCs collectés à 350 fois g et à quatre degrés Celsius pendant trois minutes pour pelleter les cellules.
En attendant la centrifugation, aspirez la matrice de la plaque dans laquelle les hPSCs seront ensemencés. Ajoutez une quantité suffisante de supports mTeSR aux puits destinataires pour les couvrir. Lorsque la centrifugation est terminée, aspirez soigneusement le supernatant, en laissant les hPSCs granulés au fond du tube conique.
Resuspendez la pastille cellulaire dans mTeSR complétée par un micromolaire de Thiazovivin obtenu commercialement. À l’aide d’une pipette P1000, triturer délicatement deux à trois fois pour résusquer uniformément la pastille cellulaire en une seule suspension cellulaire. Pipette immédiatement 10 microlitres de la suspension cellulaire dans un hémocytomètre et compter le nombre de cellules.
Ajustez le volume des hPSCs résuspendus avec le mTeSR complété par Thiazovivin pour atteindre la concentration cellulaire désirée pour le placage. Ensuite, secouez la plaque en croix plusieurs fois pour vous assurer que les cellules sont réparties uniformément. Une fois que les hPSC ont été plaqués pendant au moins 24 heures, utilisez un microscope à contraste de phase pour vérifier la morphologie des cellules en mettant l’accent sur le diamètre des colonies de hPSC plaquées.
Ensuite, préparez le premier jour de différenciation APS tel que décrit dans le tableau deux du protocole texte. Un jour après l’ensemencement, aspirez le mTeSR complété par Thiazovivin des hPSCs plaqués et lavez-les brièvement avec des supports IMDM. Après cela, ajouter le premier jour moyen aux hPSCs.
Enregistrez l’heure et placez les cellules dans l’incubateur à 37 degrés Celsius. Continuez avec les étapes de différenciation suivantes en préparant le support de différenciation nécessaire et en l’ajoutant aux cellules les jours respectifs de différenciation à peu près à la même heure de la journée. Dans cette étude, des populations enrichies d’progéniteurs de bourgeons hépatiques et, par la suite, de cellules hépatocytes sont générées à partir de hPSCs.
Au deuxième jour de différenciation, les cellules primitives de strie se sont différenciées en cellules endoderm définitives de jour deux. La grande majorité de ces cellules expriment SOX17 et FOXA2. Au troisième jour de différenciation, les cellules endoderm se sont différenciées en progéniteurs de foregut qui semblent polygonaux dans la forme.
Plus tard, au sixième jour, les progéniteurs de foregut se sont différenciés en progéniteurs de bourgeons hépatiques. Ces progéniteurs de bourgeon de foie expriment AFP, TPX3, et HNF4alpha. Dans trois lignées hPSC, cette méthode génère des progéniteurs hépatiques positifs à l’AFP six jours à une efficacité d’environ 89%Enfin, après 18 jours de différenciation hépatique des hPSCs, albumin-positif hépatocyte-comme des cellules apparaissent.
Morphologiquement, ces cellules apparaissent épithéliales, formant des bordures lumineuses rappelant le canaliculi biliaire. À ce stade, le cytoplasme des hépatocytes dérivés du jour 18 hPSC semble plus foncé que le noyau. Lors de l’ensemencement des cellules souches pluripotentes humaines pour la différenciation, il est impératif de les ensemencer à la bonne densité et aussi de les répartir à travers le puits en secouant la plaque.
La capacité de produire des hépatocytes humains in vitro est une technologie habilitante qui permettra aux scientifiques d’étudier les mécanismes sous-jacents au développement du foie. Cette méthode produit un grand nombre d’hépatocytes humains in vitro qui pourraient être utilisés pour étudier la fonction hépatique et la maladie et pour éventuellement permettre de nouvelles thérapies pour l’insuffisance hépatique.
