המחברים רוצים להכיר את הסיוע של גב &#39;סו Connell עבור המומחיות שלה הטבעה שרף גב קברים סטפניה עבור המומחיות שלה במעבדה. המחברים מבקשים להודות פרופסור פרנק Kandziora ד&quot;ר מארי אן Polboth עבור עצתם.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמה ממוקם מיכל אטום המכיל פוספט 10% שנאגרו פתרון פורמלין 3. להבטיח חשיפה מינימלית לאור, אם ניתוח fluorochrome יש לבצעם, כמו fluorochromes הם רגישים לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקם אשר האוריינטציה של רקמת יידרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את הדגימה לגודל, בכיוון הנכון, באמצעות הלהקה ראה. ודא אמצעי בטיחות הם דבקו. הדגימה ממוקם מכן לתוך מיכל אטום, היקף אשר אמור להיות בערך עשר פעמים את גודל הדגימה להשיג קיבעון הולם. הדגימה צריך להישאר הפתרון פורמלין סך של בין שבוע עד שבועיים, בהתאם לגודלה. הוא הציע להשתמש רקמות מלאה לבדיקה למטרות אופטימיזציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדיקת רקמות מתאים לתבנית הטבעה והמקום רקמה לתוך מיכל אטום המכיל אטום אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך הרקמה עולה ריכוזי אתנול, מיגון מאור ותחת תסיסה מתמדת. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 70% אתנול 1 שבוע </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 80% אתנול 1 שבוע </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 90% אתנול 1 שבוע </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100% אתנול 1 שבוע </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרקמה אינה מסומנת ולאחר מכן במשך שבוע 1 ב butanol, שוב מיגון מאור ותחת תסיסה מתמדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפיפות של שרף ואת העצם צריך להיות מתאימים מקרוב. צפיפות שרף ניתן לשנות (ראה שלב 8) ואנו ממליצים הטבעה טיפוס המבחן הראשון כדי להבטיח את צפיפות נכונה. אנו משתמשים Technovit 7100 (Heraeus Kulzer) עבור מיקרוסקופ אור וניתוח fluorochrome. אם אימונוהיסטוכימיה נדרש שרף אלטרנטיבה יש להשתמש כגון Technovit 9100 (Heraeus Kulzer). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון 7100 Technovit הכנה עשוי להיות מעורב עם aliquots קטן של הפתרון ריכוך המסופק עם ערכת, אם נדרש, אך לא יותר מ% 5 את עוצמת הקול של פתרון הכנה; בחוויה שלנו את הפתרון ריכוך נדרשת לעתים רחוקות. חלקים שווים של אתנול מוחלט נוזלי בסיס Technovit 7100 מעורבבים ויישומי לרקמה כפתרון חדירה מראש למשך 24 שעות וצמצום החשיפה אור בהתרגשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון חדירה אז הוא עשה את השימוש 1 hardener גרם לי (= 1 שקית) אשר מומס בנוזל 100 מ&quot;ל בסיס. זה מחליף את הפתרון מראש חדירה מותר לחדור שבוע 1 תחת תסיסה מתמדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התבנית לתוך הרקמה, עם פני משטח חיתוך למטה. ודא שיש שוליים (רצוי לפחות 5 מילימטרים) סביב הרקמה עבור שרף, זה מבטיח חוזק לחסום. מערבבים 15mls של פתרון 7100 הכנה Technovit עם 1 מ&quot;ל של hardener II ויוצקים מסביב הדגימה בתוך התבנית ולכסות על ידי לפחות 5 millimietres. אשפרה יחל בתוך 2 שעות אבל תהיה שלמה בן לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכבה מבוצעת אז בעיצוב בלוק גיבוי באמצעות Technovit 3040 (Heraeus Kulzer). מערבבים Technovit 3040 ביחס נפח של 2 חלקים אבקה לנוזל חלק 1 להשיג נוזל צמיג. יוצקים Technovit 3040 לתוך ההפסקה בחלק האחורי של הבלוק לרמה של לפחות 2 מ&quot;מ מעל הבסיס של הבלוק. לאחר כ -10 דקות עובש ניתן התקלף ולחסום את מוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפיפות ולכן המאפיינים החנית של שרף methacrylate רגישים ללחות הסביבה בחדר. בלוקים ולכן צריך להיות מאוחסן dessicator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתך קרקע מייצרת חלקים גדולים יותר בין 20-50 מיקרומטר עובי. זה שימושי עבור ניתוח fluorochrome (ראה סעיף למטה) כמו בסעיפים עבה לייצר הקרינה בהיר. אבטח את להב היהלום macrotome. הוסף חומר סיכה, כמו רוח נפט למאגר על macrotome. אבטח את לחסום מהדק ו להתמצא ללהב. אפשר שחיקה להתרחש לאט (כ 20-30 דקות לכל קטע) להבטיח שימון הולם. החלק הראשון חושף את הפנים חיתוך orientates סעיף זה צריך להיות מושלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסעיף הבא הוא הניח אז בשקופית Superfrost פלוס. בסעיף יש נטייה להתכרבל כך מומלץ למקם חלק שקית סנדוויץ&#39; על זה ואז מחזיק אותו שטוח עם שקופיות אחר הידק במקום. זה ממוקם אז בין 60-80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 לתוך באינקובטור של. זה מרכך את methacrylate ומסייע בסעיף לדבוק לשקופית באופן שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף הקרקע ניתן לנקות ומלוטש כנדרש באמצעות נייר זכוכית חצץ דק בצורה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microtome המזחלת קיצוצים בסעיפים רזה, המספק את החלקים הטובים ביותר microsocopy אור. השתמש microtome המזחלת כפי שהוא הוסיף קשיחות, אשר נדרש לחיתוך אלה בלוקים קשה. לחילופין microtome סיבובי מופעל ניתן להשתמש. השתמש בלהב חד נירוסטה. עדיף יש שני להבים זמין כאחד ניתן חידד את השני משמש. הלהב צריך לעשות בזווית של 45 מעלות עם הבלוק. סוריכוך rface יכולה להיות מושגת על ידי החלת נייר רטוב כדי לחסום את הצורך. זה עלול לקחת כמה סעיפים על מנת להשיג את התנאים חיתוך הרצוי כדי להשיג קטע איכותי. בסעיף הוא צף אז על אמבט מים והניח בשקופית כמו 16 לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאגנטים מכתים מפורטים חומרים למטה. הפרוטוקולים מבוססים על בנקרופט 4 et al. עקב וריאציה עובי מומלץ לבצע אופטימיזציה כתמים בשקופיות הבדיקה. מכתים Rack עלול לגרום רקמות לצוף מעל השקופית כך להוסיף את הכתמים ישירות לשקופית שטוח ייתכן שתידרש. פרוטוקול זהה או מכתים מתלה הוא הכרחי עבור תוצאות עקביות מכתים נדרש histomorphometry. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Haematoxylin ו Eosin <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם עם 5-10 דקות Haematoxyilin </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף היטב עם מים מהברז של סקוט </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם עם Eosin 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף במי ברז </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה קסילן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמוי עצם = ורוד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצם מסויד = חום אדמדם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כחול = גרעינים </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פון Kossa <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום תמיסת כסף חנקתי ולחשוף לאור חזק עד העצם mineralized הופך שחור (10 דקות בערך) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף במים מזוקקים שלוש פעמים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איום עם thiosulfate נתרן במשך 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף במים מזוקקים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstain עם Safrinin O </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה קסילן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצם Mineralised = שחור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמוי עצם = אדום / ורוד </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאסון גולדנר s Trichrome <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם אלכוהול אלקליין (90mls של 80% אתנול ו 10mls של אמוניה 25% למשך 20 דקות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף במים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו במים מזוקקים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם עם Haematoxylin Weigert של 10 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו במים מזוקקים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם עם הפתרון הסופי Ponceau-Fuchsin 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם חומצה אצטית 1% 15 שניות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם phosphomolybdic חומצה כתום פתרון G 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם חומצה אצטית 1% 15 שניות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם אור ירוק 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם חומצה אצטית 1% 3 שינויים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו במים מזוקקים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצם Mineralised = ירוק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמוי עצם = אדום / כתום </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> = גרעינים כחול אפור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סחוס = סגול </li></ol></li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fluorochrome ההכנות: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלה בזריקה תוך ורידי איטי, לפחות שבועיים זה מזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מינון <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Calcein גרין 10 מ&quot;ג / ק&quot;ג IV </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Oxytetracycline 50 מ&quot;ג / ק&quot;ג IV </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Alizarin Complexone 30 מ&quot;ג / ק&quot;ג IV </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Calcein גרין <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרם אחד של Calcein הירוק הוא טיטרציה עם NaOH 1 M עד שהיא נמסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה-pH מותאם עם NaOH 1% עד pH = 7.1-7.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינון לשמור מוגן מפני האור </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Alizarin Complexone <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה גרם של Alizarin complexone היא טיטרציה עם NaOH 1 M עד שהיא נמסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה-pH מותאם אז עד pH = 7.1-7.2 עם HCl או NaOH 1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינון לשמור מוגן מפני האור </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Oxytetracycline <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Oxytetracycline זמין כתרופה אנטי מיקרוביאליים מהמדף. הכנה לא נדרש. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kerr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Atlas of Functional Histology. , 164-168 (2000).</li><li>Parfitt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+histomorphometry:+standardization+of+nomenclature,+symbols,+and+units.+Report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee.">Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> J Bone Miner Res. 2, 595-610 (1987).</li><li>An, Y. H., Martin, K. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of histology methods for bone and cartilage. , (2003).</li><li>Bancroft, J. D., Gamble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and Practice of Histological Techniques. , 352-360 (2008).</li></ol>

ממיסים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10% Normal שנאגרו חומצה אתנול פורמלין, קסילן Butanol כל כיתה היסטולוגיה, ללא גופרית. Grale מדעי Pty בע&quot;מ http://www.grale.com.au </li></ul> Moulds: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיל משם, תבניות פלסטיק Grale מדעי </li></ul> שקופיות: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SUPERFROST PLUS שקופיות מיקרוסקופ לומב מדעי Pty בע&quot;מ <a href="http://www.lomb.com.au/">http://www.lomb.com.au</a> </li></ul> שרף: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> GlycolMethacrylate Technovit 7100 Heraeus Kulzer <a href="http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm">http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גיבוי שרף-Technovit 3040 בלוק בלוק histo Heraeus Kulzer </li></ul> כתמים (ריאגנטים מ Grale מדעי) Trichrome גולדנר של כתם </li> 1. Weigert של ברזל hemotoxylin (DeGroat) <table style="margin-left:40px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> א) Hemotoxylin פתרון </td></tr><tr><td> Hemotoxylin </td><td> 1g </td></tr><tr><td> Absolute אלכוהול </td><td> 100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> ב) ברזל פתרון </td></tr><tr><td> 30% כלור וברזל מימית </td><td> 4mL </td></tr><tr><td> חומצה הידרוכלורית (מרוכז) </td><td> 1mL </td></tr><tr><td> מים מזוקקים </td><td> 95mL </td></tr></table> מסוננים והוסיף נפח שווה של hemotoxylin מיד לפני כתם בשימוש. 2. Ponceau-fuchsin-azophloxin מניות פתרונות <table style="margin-left:40px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> א) Ponceau דה פתרון xylidine </td></tr><tr><td> Ponceau דה xylidine </td><td> 0.75g </td></tr><tr><td> חומצה fuchsion </td><td> 0.25g </td></tr><tr><td> חומצה אצטית </td><td> 1mL </td></tr><tr><td colspan="2"> לערבב, ולהוסיף מים מזוקקים (100 מ&quot;ל) </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> ב) azophloxin פתרון </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> חומצה אצטית </td><td> 0.6mL </td></tr><tr><td colspan="2"> לערבב, ולהוסיף מים מזוקקים (100 מ&quot;ל) </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> ג) פתרון סופי עבודה כתם </td></tr><tr><td> Ponceau-fuchsin פתרון </td><td> 5-10ml </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 2ml </td></tr><tr><td> 0.2% חומצה אצטית פתרון </td><td> 88mL </td></tr></table> 3. הפתרון אור ירוק <table style="margin-left:40px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tr><td> אור ירוק </td><td> 1g </td></tr><tr><td> חומצה אצטית </td><td> 1mL </td></tr><tr><td colspan="2"> לערבב, ולהוסיף מים מזוקקים (500ml) </td></tr></table> 4. Phophomolybdic חומצה אורנג&#39; G פתרון <table style="margin-left:40px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tr><td> Phosphomolybdic חומצה </td><td> 3g </td></tr><tr><td> אורנג&#39; G </td><td> 2g </td></tr><tr><td colspan="2"> להמיס 500ml של מים מזוקקים ולהוסיף תימול קריסטל. </td></tr></table> פון Kossa כתמים <table style="margin-left:40px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tr><td> 1% חנקת הכסף מימית </td></tr><tr><td> נתרן 2.5% thiosulfate </td></tr><tr><td> 1% safranin O </td></tr></table> Alcian כתם כחול <table style="margin-left:40px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tr><td> Alcian כחול 8GX </td><td> 1g </td></tr><tr><td> 3% חומצה אצטית פתרון </td><td> 100 מ&quot;ל </td></tr></table> Hemotoxylin ו Eosin כתם <table style="margin-left:40px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> א) האריס hemotoxylin </td></tr><tr><td> Hemotoxylin </td><td> 2.5G </td></tr><tr><td> Absolute אלכוהול </td><td> 25mL </td></tr><tr><td> אשלגן אלום </td><td> 50 גרם </td></tr><tr><td> מים מזוקקים </td><td> 500ml </td></tr><tr><td> כספיתי תחמוצת </td><td> 1.25g או </td></tr><tr><td> נתרן iodate </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> חומצה אצטית קרחונית </td><td> 20mL </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> ב) Eosin פתרון </td></tr><tr><td colspan="2"> Eosin המיוצר מסחרית היה בשימוש. </td></tr></table> כל אבקות צבע הכתם הם Gurr אבקות צבע. ריאגנטים כל ריאגנטים אנליטיים, ולא מעבדת ריאגנטים Fluorochromes <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> יצרן </td><td> Fluorochrome </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> סיגמא אולדריץ, סידני </td><td> Calcein גרין </td><td> C0875 </td></tr><tr><td> סיגמא אולדריץ, סידני </td><td> Alizarin Complexone </td><td> A3882 </td></tr><tr><td> Intervet אוסטרליה, ויקטוריה </td><td> Oxytetracycline (את התרופה מדף מיקרוביאלית) </td><td> Tradename; Engemycin 100 </td></tr></table>

undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis

היסטולוגיה עצם Undecalcified מדגים את המיקרו ארכיטקטורה של העצם. זה מראה גם את הרכיבים mineralized ואת התאי של העצם, אשר מספק מידע חיוני על מחזור או עצם היווצרות העצם resorption. זה יש חשיבות עצומה במגוון רחב של יישומים קליניים ומחקר. זה מניב תמונות יפות 1 ומאפשר טכניקות כגון הערכה fluorochrome ו histomorphometry 2. ניתוח Fluorochrome היא טכניקה שבה צבעי ניאון אשר נקלטות על ידי סידן מוזרקים בנקודת זמן מסוימת, אשר מאפשרת כימות של כמות מינרליזציה באותו זמן נתון. Histomorphometry זהו תהליך של כימות העצם ברמה המיקרוסקופית. עצם ביצוע היסטולוגיה undecalcified מבחינה טכנית מאתגרת, במיוחד עם דגימות גודל גדול. זה דורש שינויים טכניקה מאלה המשמשים פרפין תקן מוטבע היסטולוגיה. וידאו זה ממחיש את תהליך ייצור חלקים באיכות טובה מדגים את הקשיים הטכניים ושיטות שבה להתגבר עליהם. הכנת הדגימה, קיבעון ועיבוד מושגות עם באופן דומה רקמות רכות אחרות, אולם בשל לצפיפות וחדירות התחתון של עצם ניכרת קיבעון ארוך פי עיבוד נדרשים, לעיתים לוקח מספר שבועות. הטבעת מושגת באמצעות מדיום תמיכה עם קשיות דומה או שווה צפיפות העצם כגון methacrylate מבוססי שרפים, אך בניגוד חדירת פרפין והטבעה, זהו צעד בלתי הפיך. חתך ניתן להשיג על ידי שחיקה אשר מייצרת חלק עבה, שהוא אופטימלי עבור מחקרים כגון ניתוח fluorochrome. זו מושגת באמצעות מיטב להב היהלום על macrotome. לחלופין, קטעים רזה יכול להיות מיוצר עבור מיקרוסקופ אור זו מושגת באמצעות microtome המזחלת עם סכין חדה מאוד. Microtome המזחלת מספק את הכוח יציבות נוספים הדרושים, בלוקים גדולים קשה. שרף חלקים מוטבע יכול להיות מוכתם עם מגוון רחב של כתמים, אשר הפגינו.

Watch this Scientific Journal Video about Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis at JoVE.com

Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

היסטולוגיה עצם Undecalcified מספק מידע חשוב עבור מגוון של יישומים קליניים ומחקר. זה מאתגר מבחינה טכנית, בעיקר עם דגימות גודל גדול. וידאו זה ממחיש את תהליך ייצור חלקים באיכות טובה מדגים את הקשיים הטכניים ושיטות שבה להתגבר עליהם.

עצם הכנת Undecalcified עבור היסטולוגיה, Histomorphometry וניתוח Fluorochrome

Undecalcified bone histology demonstrates the micro-architecture of bone. It shows both the mineralised and cellular components of bone, which provides ...

undecalcified-bone-preparation-for-histology-histomorphometry

Research

JoVE Journal

Biology

27.1K Views.  Monash University. היסטולוגיה עצם Undecalcified מספק מידע חשוב עבור מגוון של יישומים קליניים ומחקר. זה מאתגר מבחינה טכנית, בעיקר עם דגימות גודל גדול. וידאו זה ממחיש את תהליך ייצור חלקים באיכות טובה מדגים את הקשיים הטכניים ושיטות שבה להתגבר עליהם.

Video: Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a plethora of mutant strains and technical tricks have been developed to allow sophisticated questions to be asked and answered in a reasonable amount of time. Fundamental insight into the interplay of components of all known major signaling pathways has been obtained in forward and reverse genetic Drosophila studies. The fly eye has proven to be exceptionally well suited for mutational analysis, since, under laboratory conditions, flies can survive without functional eyes. Furthermore, the surface of the insect eye is composed of some 800 individual unit eyes (facets or ommatidia) that form a regular, smooth surface when looked at under a dissecting microscope. Thus, it is easy to see whether a mutation might affect eye development or growth by externally looking for the loss of the smooth surface ('rough eye' phenotype; Fig. 1) or overall eye size, respectively (for examples of screens based on external eye morphology see e.g.1). Subsequent detailed analyses of eye phenotypes require fixation, plastic embedding and thin-sectioning of adult eyes.
The Drosophila eye develops from the so-called eye imaginal disc, a bag of epithelial cells that proliferate and differentiate during larval and pupal stages (for review see e.g. 2). Each ommatidium consists of 20 cells, including eight photoreceptors (PR or R-cells; Fig. 2), four lens-secreting cone cells, pigment cells ('hexagon' around R-cell cluster) and a bristle. The photoreceptors of each ommatidium, most easily identified by their light sensitive organelles, the rhabdomeres, are organized in a trapezoid made up of the six "outer" (R1-6) and two "inner" photoreceptors (R7/8; R8 [Fig. 2] is underneath R7 and thus only seen in sections from deeper areas of the eye). The trapezoid of each facet is precisely aligned with those of its neighbors and the overall anteroposterior and dorsoventral axes of the eye (Fig. 3A). In particular, the ommatidia of the dorsal and ventral (black and red arrows, respectively) halves of the eye are mirror images of each other and correspond to two chiral forms established during planar cell polarity signaling (for review see e.g. 3).
The method to generate semi-thin eye sections (such as those presented in Fig. 3) described here is slightly modified from the one originally described by Tomlinson and Ready4. It allows the morphological analysis of all cells except for the transparent cone cells. In addition, the pigment of R-cells (blue arrowheads in Fig. 2 and 3) can be used as a cell-autonomous marker for the genotype of a R-cell, thus genetic requirements of genes in a subset of R-cells can readily be determined5,6.

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

A standard approach to prepare adult Drosophila eyes for semi-thin sectioning and light microscopic analysis is presented here. The protocol can be used for gross morphological analysis of eye defects, or with the indicated adjustments can be used to determine genetic requirements of genes in specific cell types of the eye (e.g. clonal analysis of photoreceptors) or for electron microscopic analysis.

הכנת למבוגרים תסיסנית עיניים עבור חתך דק ניתוח מיקרוסקופי

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

רנ&quot;א<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בעוברי הר שלמים והיסטולוגיה הסלולרית מותאמת לElasmobranchs הימי

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing bone, they also support the complex process of bone regeneration. This favorable behavior of autografts is attributed to the three characteristics: osteoconductivity, osteogenicity, and osteoinductivity. However, there is another aspect: Bone grafts release a myriad of molecules, including growth factors, which can target mesenchymal cells involved in bone regeneration. The paracrine properties of bone grafts can be studied in vitro by the use of bone-conditioned medium (BCM). Here we present a protocol on how to prepare bone-conditioned medium from native pig cortical bone, and bone that underwent thermal processing or demineralization. Cells can be directly exposed to BCM or seeded onto biomaterials, such as collagen membranes, previously soaked with BCM. We give examples for in vitro bioassays with mesenchymal cells on the expression of TGF-&#946; regulated genes. The presented protocols should encourage to further reveal the paracrine effects of bone grafts during bone regeneration and open a path for translational research in the broad field of reconstructive surgery.

We describe here how to prepare bone-conditioned medium (BCM) and test its activity in vitro.

בינוני אוויר עצם: הכנה ומבדק

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

לדוגמא הכנה לניתוח Cytometry Mass

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

גישה חלופית עבור הכנת דוגמאות עם מספר סלולרי נמוך עבור ניתוח TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly expanded our understanding of certain diseases. Mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as a powerful tool to unravel alterations in the molecular mechanisms and protein signaling pathways in the vascular beds in health and disease. However, sample preparation steps prior to MS analyses are crucial to obtain reproducible results and in-depth elucidation of the complex proteome. This is particularly important for preparation of ocular microvessels, where the amount of sample available for analyses is often limited and thus, poses a challenge for optimum protein extraction. This article endeavors to provide an efficient, rapid and robust protocol for sample preparation from an exemplary retrobulbar ocular vascular bed employing the porcine short posterior ciliary arteries. The present method focuses on protein extraction procedures from both the supernatant and pellet of the sample following homogenization, sample cleaning with centrifugal filter devices prior to one-dimensional gel electrophoresis and peptide purification steps for label-free quantification in a liquid chromatography-electrospray ionization-linear ion trap-Orbitrap MS system. Although this method has been developed specifically for proteomics analyses of ocular microvessels, we have also provided convincing evidence that it can also be readily employed for other tissue-based samples.

Proteome characterization of ocular microvascular beds is pivotal for in-depth understanding of many ocular pathologies in humans. This study demonstrates an effective, rapid, and robust method for protein extraction and sample preparation from small blood vessels employing the porcine short posterior ciliary arteries as model vessels for mass-spectrometry-based proteomics analyses.

הכנת הדוגמא מסה ספקטרומטר מבוססת על ניתוח פרוטאומיקס של עינית Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been studied substantially using traditional two-dimensional techniques. Recent advancements in X-ray imaging technology via desktop micro-computed tomography (&#181;CT) and synchrotron radiation micro-computed tomography (SR&#181;CT) have allowed for the acquisition of high-resolution three-dimensional (3D) scans of a larger field of view (FOV) than other 3D imaging techniques (e.g., SEM) providing a more complete picture of microscopic structures within human cortical bone. The specimen should be accurately centered within the FOV, however, to limit the appearance of streak artifacts known to impact data analysis. Previous studies have reported procurement of irregularly shaped rectilinear bone blocks that result in imaging artifacts due to uneven edges or image truncation. We have applied a geological sampling protocol (coring) to procure consistently sized cortical bone core specimens for SR&#181;CT experiments from the anterior aspect of human femora. This coring method is efficient and minimally destructive to tissue. It creates uniform cylindrical samples that decrease imaging artifacts by nature of being isometric during rotation and providing a uniform path length for X-ray beams throughout scanning. Image processing of X-ray tomographic data of cored and irregularly shaped samples confirms the potential of the technique to improve visualization and analysis of cortical bone microarchitecture. A goal of this protocol is to deliver a reliable and repeatable method for the extraction of cortical bone cores that is adaptable for various types of high-resolution bone imaging experiments. An overarching goal of the work is to create a standardized cortical bone procurement for SR&#181;CT that is affordable, consistent, and straightforward. This procedure may further be adapted by researchers in related fields who commonly evaluate hard composite materials such as in biological anthropology, geosciences, or material sciences.

We employed a geological (coring) sampling protocol to procure cortical bone specimens of uniform size for SR&#181;CT experiments from the anterior aspect of human femora. This method is minimally destructive, efficient, results in cylindrical specimens that minimize imaging artifacts from irregular sample shapes and improves microarchitectural visualization and analysis.

מדריך מקטעים, קורינג ועיבוד תמונה לרכש וניתוח מדגם עצם קליפת המוח בעל תפוקה גבוהה עבור מיקרו-CT של Synchrotron

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty (TKA) is a common surgical intervention. Experiments using primary human OA tissues obtained from TKA provide the capability to investigate disease mechanisms ex vivo. While OA was previously thought to impact mainly the cartilage, it is now known to impact multiple tissues in the joint. This protocol describes patient selection, sample processing, tissue homogenization, RNA extraction, and quality control (based on RNA purity, integrity, and yield) from each of seven unique tissues to support disease mechanism investigation in the knee joint. With informed consent, samples were obtained from patients undergoing TKA for OA. Tissues were dissected, washed, and stored within 4 h of surgery by flash freezing for RNA or formalin fixation for histology. Collected tissues included articular cartilage, subchondral bone, meniscus, infrapatellar fat pad, anterior cruciate ligament, synovium, and vastus medialis oblique muscle. RNA extraction protocols were tested for each tissue type. The most significant modification involved the method of disintegration used for low-cell, high-matrix, hard tissues (considered as cartilage, bone, and meniscus) versus relatively high-cell, low-matrix, soft tissues (considered as fat pad, ligament, synovium, and muscle). It was found that pulverization was appropriate for hard tissues, and homogenization was appropriate for soft tissues. A proclivity for some subjects to yield higher RNA integrity number (RIN) values than other subjects consistently across multiple tissues was observed, suggesting that underlying factors such as disease severity may impact RNA quality. The ability to isolate high-quality RNA from primary human OA tissues provides a physiologically relevant model for sophisticated gene expression experiments, including sequencing, that can lead to clinical insights that are more readily translated to patients.

Primary tissues obtained from patients following total knee arthroplasty provide an experimental model for osteoarthritis research with maximal clinical translatability. This protocol describes how to identify, process, and isolate RNA from seven unique knee tissues to support mechanistic investigation in human osteoarthritis.

איסוף רקמות ומיצוי RNA ממפרק הברך האוסטאוארטכרטית האנושי

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...