עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר (NIH / 009,269 NIDCD, 012,831 ומענקי NIH תוספת מנהליים ערה) לWeihong לין. תודה מיוחדת למר טים פורד בUMBC לקבלת הסיוע הטכני שלו בצילום וידאו ועיבוד. כמו כן, אנו רוצים להודות לד&quot;ר דפנה בלומברג, גב &#39;Chere פטי בUMBC ומר ניקולס מק&#39; קול מאולימפוס אמריקה בע&quot;מ לסיוע הציוד שלהם בצילום וידאו.

1. הכנת האף מאוס אנחנו השתמשנו בעכברים מבוגרים רקע C57BL / 6 במחקר זה. כל הטיפול בבעלי החיים ובנהלים שאושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים וועדות להשתמש (IACUC) מאוניברסיטת מרילנד, במחוז בולטימור. 1.1 רכישת האף מעכברי paraformaldahyde-קבועים <img src="/files/ftp_upload/50538/50538fig1.jpg" alt="איור 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50538/50538fig1highres.jpg"/> איור 1. עצמות גולגולת של עכבר: A. תצוגה הגבי של הגולגולת ב &#39;:. תצוגת הגחון של הגולגולת עם הלסת התחתונה הוסרה. הגולגולת הייתה מוכנה מעכבר בן 40 יום. עצמות בודדות הן בצבע להדמיה טובה יותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50538/50538fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse transcardially לתקן עכברים בודדים לאחר הדואר הפרוטוקול של לין, et al., (2008) 16. בקצרה, עכברים היו מורדמים עמוק עם tribromoethanol (משקל Avertin 250 מיקרוגרם / g גוף), perfused transcardially עם 0.1M פוספט חיץ (PB, 30-50 מ&quot;ל), ואחריו פוספט שנאגרו מקבע המכיל 3% paraformaldehyde, 19 מ&quot;מ L-ליזין monohydrochloride, ו0.23% נתרן מ-periodate (כ 35-50 מ&quot;ל). אפשר גם לבצע את השלבים במאמר יופיטר לזלוף בעלי החיים 35. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים כדי לחתוך את הלסת התחתונה (או הלסת התחתונה) ולהסיר את העור על הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפריד את הראש מכל שאר הגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החיך. כמו כן, לנקות ולהסיר את רקמת חיבור ושרירים שנותרו על פני השטח של הגולגולת כדי להשיג הדגימה מוצגת ב1A ו-1B דמויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתיחה, להסיר את עצם הגולגולת המכסה את המוח ואת נורות חוש הריח. לקצץ את הרקמות ועצמות עודפים. לאטה, להכנת הרקמה המורחבת שבו המוח והאף נשארים מחובר, רק את עצמות הגולגולת יוסרו. עבור ניסויי immunohistochemical, הרקמות היו שלאחר שנקבעה ל1.5 שעות והועברו ל0.1M פוספט שנאגרו מלוח (PBS) עם 25% סוכרוז בן לילה. רקמת האף צריכה להישמר לאורך humidified הנתיחה על ידי טבילתו בתמיסת סוכרוז נאגר מספר פעמים. </li></ol> 1.2 רכישת האף מעכברים טריים מורדמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים בודדים הועברו לכלוב נקי וחשוף לגז CO 2, שאחריו 5 דקות נקע בצוואר רחם לאחר הנשימה האחרונה. כדי להפחית את הדם ברקמות האף, השתמש במספריים כדי לפתוח את החזה וחתך את הלב כדי לאפשר לדם לניקוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 1.1.2 ל1.1.5, למעט לאחר הקיבוע וcryoprotection עם 25% סוכרוז. הדגימה צריכה להישמר humidified ומתוחזק עם המכיל תמיסת מלח של Tyrode (מ&quot;מ): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 1 CaCl 2, 10 פירובט Na, 10 D-גלוקוז, ו10 N-2-hydroxyethylpiperazine-רוקנ-2-ethanesulfonic חיץ החומצה (HEPES, מותאם ב-pH 7.4). לחלופין, לקפל פיסת Kimwipes, להשרות אותו עם הפתרון של Tyrode, ומקום מתחת לדגימה בזמן לנתח ומדי פעם לטבול את הדגימה בפתרון של Tyrode או להפיל איזה פתרון על הרקמות כדי לשמור אותו humidified כדי לשמור על יכולת הקיום של התאים והרקמות . </li></ol> 2. חותכת, Vomer קדמי והסרת עצם לסת עליונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל מנקודת מבט הגחון. אתר את עצם vomer ולשבור את עצם vomer לאורכו באמצעות מלקחיים או rongeur עם שיניים כדי לשבור את רוב הגחון של העצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים משוננים, להסיר את הקטעים שבורים של עצם vomer בעדינות על ידי משוטטות את שברי העצמות מאיבר יעקובסון (VNO). שימו לב, לעכברים פחות מבן חודש, או אם מעוניין רק במשרד החינוך, אלה שני STEניתן לדלג PS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזק היטב את הראש עם מלקחיים. השתמש rongeur לשבור את החלק הקדמי של שני שיניים חותכות ואזור מפרקים של לסת עליונה קדמית בין שתי השיניים החותכות ועצם vomer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור את החלק הגחוני של הלסת העליונה הימנית באזור רק הקדמי לקשת עד לרמה של צלחת הזיגומטית הגבי הזיגומטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעיף מעל האף לנקודת מבט הגבי. השתמש rongeur לשבור את הלסת העליונה קדמי הימנית של צלחת הזיגומטית הגבי. קדמי הלסת העליונה הימנית של כל צלחת הזיגומטית צריך להיות משוחרר. השתמש במלקחיים העדינים להפריד כל רקמת האף בסיס הלסת העליונה בעדינות, ולאחר מכן בעדינות להרים משם שבר העצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.4 ו 2.5 כדי לשחרר את השן החותכת השמאלית ולסת העליונה קדמית שמאלית ולהסיר אותם לאחר עצם האף הוסר. </li></ol> 3. עצם האף והסרת פלייט הזיגומטית הגבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחיים המשוננים או rongeur מחדשלהעביר את שארית העצמות הקדמיות רק הזנב לעצמות האף. לאחר הסרת פיסת עצם זה, ניתן אחז בחלק הזנב של עצם האף באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש rongeur לשבור את החלק הקדמי של קשת הזיגומטית, אשר מחוברת לצלחת הזיגומטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את המלקחיים העדינים בקצה הלטרלי של סוף הגב של צלחת הזיגומטית והעדינות להעיף את העצם ולהסיר אותו. אם העצם לא רופף, השתמש rongeur כדי לצבוט אותו בעדינות כדי לשחרר אותו להסרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בסכין גילוח מלקחיים או קנס כדי לשחרר את התפר המדיאלי בין עצמות האף הימניות והשמאליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחיים המשוננים לאחוז סוף הזנב של עצם האף הימני. בעדינות להזיז את העצמות מצד לצד כדי להפריד אותו מבסיס רקמות. זה שימושי כדי להעביר את המלקחיים יחד שלישי הזנב של עצם האף להעברה לצד העצם לצד. כמו עצם האף מפריד, לאט להרים את העצם מקצה הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמנם לאהוא עצם האף מעט מורם, הטה את העצם רוחבי לחשוף בליטה לרוחב של העצם שהוא מצופה ברקמת אפיתל נשימה דקה. שימוש במלקחיים בסדר לשחרר רקמה זו בעדינות מעצם האף. תמשיך להרים את עצם האף. כאשר העצם מופרד לחלוטין מהרקמה בסיסית, השתמש במספריים כדי לחתוך את עצם האף בסוף מקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1, 3.5 ו -3.6 להסרת עצם האף שמאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.2 ו -3.3 לצד השמאלי של האף. </li></ol> 4. הסרת פלייט הזיגומטית לרוחב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת צד אחד הזיגומטית בכל פעם. כך או צלחת הזיגומטית ניתן להסיר ראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנקודת מבט הגחון, לשבור את הלסת העליונה נחות קשת הזיגומטית עד הפסקה מגיעה לקשת הזיגומטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנקודת מבט הגבי, בעדינות לתפוס את קשת הזיגומטית ולהרים את קדימה ורוחב. אם צלחת הזיגומטית עדיין מחוברת לכל רקמה, לקחת את הקנסמלקחיים ועדינות לנתק את הקשרים בין הרקמות והעצמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה עבור צלחת הזיגומטית בצד השני של האף. </li></ol> 5. הסרת עצם אורביט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנקודת מבט הגחון, לשבור את עצמות palantine בין הטוחנות של האף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש rongeur לשבור את 3 שיניים טוחנות והלסת עליונה בכל צד של האף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור ולהסיר את כל חתיכות עבות הנותרות של עצם הגחון ואחוריות לturbinates בכל צד של האף. </li></ol> 6. הסרת עצם כברתי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור את כל חלק של העצם כברתי הזנב הבולט לturbinates. זה הכרחי כדי למנוע אובדן של רקמת חלזוני בעת הסרת חתיכות דקות של העצם כברתי מכסות את turbinates. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצדו הימני של החרטום, הנח את המלקחיים העדינים בקצה הקדמי של העצם כברתי בעדינות ולהסיר אותו. אם חלק של העצם נשאר, לחזור על הליך זה עד שכל<html> העצם הדק המכסה את turbinates הוסר. עצמות חלזוני לא צריכים להסיר ברוב של ההכנות. בעכברים בגיל, צלחת cribriform הופכת פריכה. אם יש צורך cryosectioning של רקמות האף, להסיר חתיכות קטנות של הצלחת עם מלקחיים עדינים כדי להפחית את נזק הפוטנציאלי שנגרם על ידי העצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 6.2) לצד השמאלי של האף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא את כל שברי עצמות שנותרו לפני חתך. הערה: בחיות יותר מ, אזור posterodorsal בת של עצם מחץ היא מעט עבה וקשה. אפשר להסיר את החלק הזה באמצעות מלקחיים בסדר. הכנס את הקצה של המלקחיים לצד השני של העצם כדי להפריד את החלק הגבי של עצם מחץ ורקמת האפיתל המצפה. השתמש זוג מלקחיים כדי לתפוס את העצם ולהחזיק את הדגימה. השתמש בזוג נוסף של מלקחיים כדי לשבור את החלק הגרמי העליון מחלק הסחוסים התחתון של מחיצת האף בעדינות ולהסיר אותו. </li></ol>&gt; 7. הכנה לאף cryosectioning <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את משאבת ואקום aspirator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האף בעובש הטבעה. להטביע את האף בתקשורת אוקטובר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בשואב אבק כדי להסיר בועות אוויר שנלכדו בתוך רקמת האף. תהליך זה נמשך עד 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת בועות אוויר, הגדר את הרקמה בכיוון הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את אוקטובר ורקמות בתבנית בעזרת קרח יבש. הרקמה מוטבעת אז יכולה להיות cryosectioned מייד או מאוחסנת ב -80 ° C לשימוש עתידי. </li></ol>

<ol>
	<li>Naclerio, R. M., Pinto, J., Assanasen, P., Baroody, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+ability+of+the+nose+to+warm+and+humidify+inspired+air.">Observations on the ability of the nose to warm and humidify inspired air.</a> Rhinology. 45, 102-111 (2007).</li><li>Bjermer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nose+as+an+air+conditioner+for+the+lower+airways.">The nose as an air conditioner for the lower airways.</a> Allergy. 54, 26-30 (1999).</li><li>Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+olfactory+system+makes+sense+of+scents.">How the olfactory system makes sense of scents.</a> Nature. 413, 211-218 (2001).</li><li>Bryant, B., Silver, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemisthesis: The common chemical sense. , (2000).</li><li>Gross, E. A., Swenberg, J. A., Fields, S., Popp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+morphometry+of+the+nasal+cavity+in+rats+and+mice.">Comparative morphometry of the nasal cavity in rats and mice.</a> J. Anat. 135, 83-88 (1982).</li><li>Halpern, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+and+function+of+the+vomeronasal+system.">The organization and function of the vomeronasal system.</a> Annu. Rev. Neurosci. 10, 325-362 (1987).</li><li>Rodolfo-Masera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Su+l'esquoestizenza+di+un+particulare+organo+olfacttivo+nel+setto+nasale+della+cavia+e+di+altri+roditori.">Su l'esquoestizenza di un particulare organo olfacttivo nel setto nasale della cavia e di altri roditori.</a> Arch. Ital. Anat. Embryol. 48, 157-212 (1943).</li><li>Levai, O., Strotmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projection+pattern+of+nerve+fibers+from+the+septal+organ:+DiI-tracing+studies+with+transgenic+OMP+mice.">Projection pattern of nerve fibers from the septal organ: DiI-tracing studies with transgenic OMP mice.</a> Histochemistry and Cell biology. 120, 483-492 (2003).</li><li>Storan, M. J., Key, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septal+organ+of+Gruneberg+is+part+of+the+olfactory+system.">Septal organ of Gruneberg is part of the olfactory system.</a> J. Comp. Neurol. 494, 834-844 (2006).</li><li>Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+views+on+the+distinct+but+related+roles+of+the+main+and+accessory+olfactory+systems+in+responsiveness+to+chemosensory+signals+in+mice.">Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice.</a> Horm. Behav. 46, 247-256 (2004).</li><li>Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sense+of+smell:+multiple+olfactory+subsystems.">The sense of smell: multiple olfactory subsystems.</a> Cell Mol. Life Sci. 63, 1465-1475 (2006).</li><li>Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsystem+organization+of+the+mammalian+sense+of+smell.">Subsystem organization of the mammalian sense of smell.</a> Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).</li><li>Finger, T. E., St Jeor, V. L., Kinnamon, J. C., Silver, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+substance+P-+and+CGRP-immunoreactive+nerve+fibers+in+the+nasal+epithelium+of+rodents.">Ultrastructure of substance P- and CGRP-immunoreactive nerve fibers in the nasal epithelium of rodents.</a> J. Comp. Neurol. 294, 293-305 (1990).</li><li>Papka, R. E., Matulionis, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+substance-P-immunoreactive+nerves+with+the+murine+olfactory+mucosa.">Association of substance-P-immunoreactive nerves with the murine olfactory mucosa.</a> Cell Tissue Res. 230, 517-525 (1983).</li><li>Baraniuk, J. N., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasonasal+reflexes,+the+nasal+cycle,+and+sneeze.">Nasonasal reflexes, the nasal cycle, and sneeze.</a> Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 105-111 (2007).</li><li>Lin, W., Ogura, T., Margolskee, R. F., Finger, T. E., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM5-expressing+solitary+chemosensory+cells+respond+to+odorous+irritants.">TRPM5-expressing solitary chemosensory cells respond to odorous irritants.</a> J. Neurophysiol. 99, 1451-1460 (2008).</li><li>Ogura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+microvillous+cells+in+the+mouse+main+olfactory+epithelium+and+effect+of+acetylcholine+on+olfactory+sensory+neurons+and+supporting+cells.">Cholinergic microvillous cells in the mouse main olfactory epithelium and effect of acetylcholine on olfactory sensory neurons and supporting cells.</a> J. Neurophysiol. 106, 1274-1287 (2011).</li><li>Finger, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solitary+chemoreceptor+cells+in+the+nasal+cavity+serve+as+sentinels+of+respiration.">Solitary chemoreceptor cells in the nasal cavity serve as sentinels of respiration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8981-8986 (2003).</li><li>Gulbransen, B. D., Clapp, T. R., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+solitary+chemoreceptor+cell+responses+to+bitter+and+trigeminal+stimulants+in+vitro.">Nasal solitary chemoreceptor cell responses to bitter and trigeminal stimulants in vitro.</a> J. Neurophysiol. 99, 2929-2937 (2008).</li><li>Zhao, K., Dalton, P., Yang, G. C., Scherer, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+modeling+of+turbulent+and+laminar+airflow+and+odorant+transport+during+sniffing+in+the+human+and+rat+nose.">Numerical modeling of turbulent and laminar airflow and odorant transport during sniffing in the human and rat nose.</a> Chemical Senses. 31, 107-118 (2006).</li><li>Ressler, K. J., Sullivan, S. L., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zonal+organization+of+odorant+receptor+gene+expression+in+the+olfactory+epithelium.">A zonal organization of odorant receptor gene expression in the olfactory epithelium.</a> Cell. 73, 597-609 (1993).</li><li>Vassar, R., Ngai, J., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+segregation+of+odorant+receptor+expression+in+the+mammalian+olfactory+epithelium.">Spatial segregation of odorant receptor expression in the mammalian olfactory epithelium.</a> Cell. 74, 309-318 (1993).</li><li>Fulle, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+receptor+guanylyl+cyclase+expressed+specifically+in+olfactory+sensory+neurons.">A receptor guanylyl cyclase expressed specifically in olfactory sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 3571-3575 (1995).</li><li>Juilfs, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subset+of+olfactory+neurons+that+selectively+express+cGMP-stimulated+phosphodiesterase+(PDE2)+and+guanylyl+cyclase-D+define+a+unique+olfactory+signal+transduction+pathway.">A subset of olfactory neurons that selectively express cGMP-stimulated phosphodiesterase (PDE2) and guanylyl cyclase-D define a unique olfactory signal transduction pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 3388-3395 (1997).</li><li>Lin, W., Arellano, J., Slotnick, B., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odors+detected+by+mice+deficient+in+cyclic+nucleotide-gated+channel+subunit+A2+stimulate+the+main+olfactory+system.">Odors detected by mice deficient in cyclic nucleotide-gated channel subunit A2 stimulate the main olfactory system.</a> The Journal of Neuroscience: The Official journal of the Society for Neuroscience. 24, 3703-3710 (2004).</li><li>Ishii, T., Omura, M., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+two-+and+three-color+fluorescent+RNA+in+situ+hybridization+of+the+main+and+accessory+olfactory+epithelia+in+mouse.">Protocols for two- and three-color fluorescent RNA in situ hybridization of the main and accessory olfactory epithelia in mouse.</a> J. Neurocyt. 33, 657-669 (2004).</li><li>Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X., Ma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+patterns+of+odorant+receptors+and+response+properties+of+olfactory+sensory+neurons+in+aged+mice.">Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice.</a> Chemical Senses. 34, 695-703 (2009).</li><li>Packard, A., Schnittke, N., Romano, R. A., Sinha, S., Schwob, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeltaNp63+regulates+stem+cell+dynamics+in+the+mammalian+olfactory+epithelium.">DeltaNp63 regulates stem cell dynamics in the mammalian olfactory epithelium.</a> The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 8748-8759 (2011).</li><li>Matthews, J. B., Mason, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+decalcifying+agents+on+immunoreactivity+of+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue.">Influence of decalcifying agents on immunoreactivity of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Histochem J. 16, 771-787 (1984).</li><li>Athanasou, N. A., Quinn, J., Heryet, A., Woods, C. G., McGee, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+decalcification+agents+on+immunoreactivity+of+cellular+antigens.">Effect of decalcification agents on immunoreactivity of cellular antigens.</a> J. Clin. Pathol. 40, 874-878 (1987).</li><li>Hegg, C. C., Irwin, M., Lucero, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+store-mediated+signaling+in+sustentacular+cells+of+the+mouse+olfactory+epithelium.">Calcium store-mediated signaling in sustentacular cells of the mouse olfactory epithelium.</a> Glia. 57, 634-644 (2009).</li><li>Spehr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+the+main+olfactory+system+in+social+recognition+of+major+histocompatibility+complex+peptide+ligands.">Essential role of the main olfactory system in social recognition of major histocompatibility complex peptide ligands.</a> The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 1961-1970 (2006).</li><li>Ma, M., Chen, W. R., Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+rat+and+mouse+olfactory+receptor+neurons+from+an+intact+epithelial+preparation.">Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation.</a> J. Neurosci. Methods. 92, 31-40 (1999).</li><li>Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+responses+of+mouse+olfactory+sensory+neurons+using+the+air-phase+electroolfactogram+recording.">Analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording.</a> J. Vis. Exp. (37), e1850 (2010).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).</li><li>Lin, W., Margolskee, R., Donnert, G., Hell, S. W., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+neurons+expressing+transient+receptor+potential+channel+M5+(TRPM5)+are+involved+in+sensing+semiochemicals.">Olfactory neurons expressing transient receptor potential channel M5 (TRPM5) are involved in sensing semiochemicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2471-2476 (2007).</li><li>Lin, W., Ezekwe, E. A., Zhao, Z., Liman, E. R., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM5-expressing+microvillous+cells+in+the+main+olfactory+epithelium.">TRPM5-expressing microvillous cells in the main olfactory epithelium.</a> BMC Neurosci. 9, 114 (2008).</li><li>Ogura, T., Krosnowski, K., Zhang, L., Bekkerman, M., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoreception+regulates+chemical+access+to+mouse+vomeronasal+organ:+role+of+solitary+chemosensory+cells.">Chemoreception regulates chemical access to mouse vomeronasal organ: role of solitary chemosensory cells.</a> PLoS One. 5, e11924 (2010).</li><li>Sathyanesan, A., Feijoo, A. A., Mehta, S. T., Nimarko, A. F., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profile+of+G-protein+&#946;&#947;+subunit+gene+transcripts+in+the+mouse+olfactory+sensory+epithelia.">Expression profile of G-protein &#946;&#947; subunit gene transcripts in the mouse olfactory sensory epithelia.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 84 (2013).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן, אנו הפגנו הליך צעד אחר צעד לבידוד רקמת הרחה ונשימה ללא פגע מהאף העכבר על ידי רצף הסרת העצמות המקיפות תוך חוסך הרקמה להלן. אנו מראים כי הסרת עצם זהירה יכולה לשמר גם את הרקמות העדינות ביותר בשלמותם. כמו כן, אנו חולקים תובנות שינויים אפשריים של טכניקה זו, שבה אנו מבוד?...

חלל האף היונקים מכיל סוגים שונים של רקמות ואיברים המשרתים פונקציות שונות. חלל האף מהווה חלק כניסתם של דרך הנשימה העליונה, המאפשרת נסיעות אוויר לתוך ומחוץ לריאות. שאיפת אוויר עובר דרך חלל האף שבו הוא עובר טמפרטורה ולחות אוויר 1, כמו גם ניקוי או סינון כדי להסיר חומרים רעילים ומעצבנים ומיקרואורגניזמים זיהומיות 2. שני הטיפולים מבוצעים על ידי האף epithelia ורקמות subepithelial, כולל בלוטות וכלי והנם קריטיים להגנה על דרכי הנשימה התחתונה והריאות. בנוסף לתפקידה בנשימה והגנת אפיתל, רקמות האף מכילה גם מנגנונים תחושתיים היקפיים של מערכות חוש הריח ומשולשות, אשר לזהות מגוון רחב של חומרים כימיים באוויר שעובר. תלוי באיזה מערכת מופעלת, גילוי חושי של כימיקלים באף יכול לעורר אוחוש הריח, גירוי או כאב 3,4. מערכת ההרחה ההיקפית היא מורכבת ומורכב מכמה איברי חישה ריח מופרדים אנטומית בתוך חלל האף. ביניהם, אפיתל ההרחה הראשי (משרד החינוך) הוא הגדול ביותר, המהווה כ 45-52% מepithelia האף במכרסמים 5 והוא ממוקם באזור האחורי. באזור anteroventral, יש זוג מבנים צינוריים המכונים איבר יעקובסון 6, שיושב לאורך כל צד של מחיצת האף. שתי קבוצות נוספות קטנות של עצב סנסורי חוש הריח, המכונות איבר במחיצה של Masera 7,8 וגנגליון Gruneberg 9, מתגורר יחד מחץ הגחון ואזור כניסת הגב של חלל האף, בהתאמה. איברים היקפיים אלה מכילים נוירו epithelia עם מאפיינים בולטים במורפולוגיה, ביטוי תא דה מרקר, ותפקוד פיסיולוגי. יחד הם מזהים אלפי ריחמולקולות עם רגישות מעודנת 10-12. בנוסף לאברי החישה הריח, חלל האף גם בתי מערכות חושיות אחרות. זה ידוע כי סיבי עצב משולש peptidergic נמצאים באפיתל באף, במיוחד אפיתל הנשימה 13,14. חלק מסיבים אלה לזהות כימיקלים רעילים ומעצבנים ואחראי לייזום רפלקסים הגנה כגון שיעול או התעטשות 4,15. יכולות גם להיות מזוהות תרכובות ריחניות ומריר מעצבנת על ידי אוכלוסייה שהתגלתה לאחרונה של תאים בודדים (chemosensory SCCs), שרבים מן מעוצבבים על ידי סיבי עצב משולש 16-19. SCCs אלה ממוקמים בצפיפות גבוהה יותר באזור הכניסה של חלל האף וצינורות הזנת vomeronasal, ורמז כי הם עשויים לשמש גם תפקיד הגנתי 16-18. לפיכך, אף epithelia יכול שונה באופן מהותי בתפקוד, מורפולוגיה, ובהרכב של תאים בהתאם להםמקומות אנטומיים. אפילו בתוך האפיתל יחיד ומיוחד, שיש הבדלים אזוריים. משרד החינוך הוא דוגמה אחת כזו. קווי משרד החינוך turbinates השונים, שהם מסובכים ומסולסלים מבנים. בגללם, אזורים שונים של ספיקות האוויר השונות ניסיון מו, ובכך, דיפוזיה שונה ושיעורי פינוי של מולקולות ריח נישאות באוויר 20. כמו כן, ידוע כי עצב סנסורי חוש הריח (OSNs) מבטא רצפטור ריח נתון נמצאים באחד מארבעת אזורים של לעקוף 21,22 משרד החינוך. איך זה משפיע על הבדל מיקום לא ידועה התגובה של OSN לodorants במידה רבה. בנוסף, חלק מאוכלוסיות OSN מפגינות העדפה אזורית. יש לי OSNs מבטא-Guanylyl cyclase-D (GC-D) הפצות אזוריות העדפת אזורי רחוב ללא מוצא של ectoturbinates 23,24. לאחרונה, מצאנו subpopulation של OSNs הקאנוניים שמבטא ערוץ פוטנציאל רצפטור החולף M5 (TRPM5) והוא ממוקם באזורים מועדף לרוחב וגחון 25. תוצאות אלו מצביעות על משרד החינוך שאינו אחיד. עם זאת, כמה הבדלים אזוריים אלה משפיעים על קידוד חוש הריח אינו מובן. מדובר בין השאר משום שהחקירה פיזיולוגית מעמיקה של משרד החינוך ואף הייתה מוגבלת על ידי קושי בהשגת שלמות באף epithelia עם ארגון האנטומי נשמר באמצעות שיטות קיימות. האף epithelia מוקף בעיקר על ידי העצמות הקדמיות של הגולגולת, כולל האף, הלסת העליונה, הפלטין, הזיגומטית, ועצמות כברתי. בעכברים בוגרים ומודלים של מכרסמים אחרים, העצמות האלה קשות וקשות להסרה מבלי לפגוע ברקמת האף קשורה באופן הדוק, ובמיוחד את turbinates העדין. לעתים קרובות, משמש decalcification מבוסס כימי לריכוך עצמות כדי לאפשר cryosectioning של רקמות האף למורפולוגי, immunohistochemical, ובמחקרי הכלאה באתר, עם זאת, depenדינג בגילו של בעל החיים, התהליך יכול להימשך decalcification הלילה עד 7 ימים 24,26-28. טיפול זה הוא מוגבל גם מכיוון שהיא דורשת להיות רקמה מקבע השתמרה. בנוסף, decalcification הכימי יכול להיות קשה ולהשפיע immunolabeling של כמה נוגדנים רגישים 29,30. למחקרים פיסיולוגיים, נדרשת רקמה חי, ובכך, ניסויים אלה לעתים קרובות נערכים בOSNs מבודד או פרוסות המתקבלות ממשרד חינוך ילודים עצמות גולגולת שלהם הם דקים ורכות 17,31,32. מחקרים פיסיולוגיים יכולים גם לנצל את כל הכנות הר על ידי פיצול ראש 25,33,34, אך בדרך כלל רק המשטח המדיאלי של האף הוא נגיש בקלות, הגבלת הקלטות פיסיולוגיות בתחומים אחרים. כאן, אנו מתארים שיטה יעילה פירוק עצמות, במדריך כדי להכין את רקמות האף שלמות עם השתמר ארגון האנטומי מקורי ומורפולוגיה. אנחנו ברצף להסיר את העצמות הגדולות של קדמייש צורך בגולגולת תחת מיקרוסקופ לנתיחה לחשוף אפיתל האף כמעט בשלמות לחלוטין, תוך שמירה על עצמות חלזוני דקות ללא פגע, אלא אם כן את העכברים הם ישנים מאוד וcryosectioning. אנחנו גם להרחיב את השיטה לשמירה על הקשר בין רקמות האף ונורות חוש הריח, כמו גם את שאר חלקי המוח, ובכך להקל בחינה בו זמנית של שני מעגלים היקפיים והמרכזיים. השיטה שלנו יכולה לשמש להכנת paraformaldehyde-קבוע, כמו גם טרי, רקמות האף חיים. לכן, השיטה שלנו צפויה להקל על מחקרים מורפולוגיים, immunohistochemical ופיסיולוגיים של נשימה, olfaction, ואף נזקים ומחלות.

<table border="1">
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Dissection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rongeur, 1.0 mm Jaw width</td>
 <td>World Precision Instruments (WPI)</td>
 <td>501333</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps, Dumont 3 </td>
 <td>WPI</td>
 <td>503235 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps, Dumont 55</td>
 <td>WPI</td>
 <td>14099</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps, Dumont AA</td>
 <td>Fine Science Tools (FST)</td>
 <td>11210-20</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Specimen forceps, Serrated</td>
 <td>VWR</td>
 <td>82027-440</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Operating scissors</td>
 <td>WPI</td>
 <td>501753</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iris scissors, Straight</td>
 <td>Miltex</td>
 <td>V95-304</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>SZ40</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Tissue embedding</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optimum cutting temperature (OCT) compound</td>
 <td>Sakura Finetek</td>
 <td>4583</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic embedding mold</td>
 <td>VWR</td>
 <td>15160-215 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aspirator vacuum pump</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>09-960-2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 	 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Section staining </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neutral red</td>
 <td>ACROS Organic</td>
 <td>CAS 553-24-2</td>
 <td>Nuclei staining</td>
 </tr>
</table>

an effective manual deboning method to prepare intact mouse nasal tissue with preserved anatomical organization

האף של היונקים הוא איבר רב תפקודי עם מבנים פנימיים מורכבים. חלל האף הוא מצופה epithelia השונים כגון epithelia חוש הריח, נשימה, וקשקש אשר נבדלים במידה ניכרת במקומות אנטומיים, מורפולוגיה, ופונקציות. בעכברים בוגרים, האף מכוסה בעצמות גולגולת שונות, המגביל את הגישה ניסיונית למבנים פנימיים, במיוחד אלה בכזה אחורי כאפיתל ההרחה הראשי (משרד החינוך). כאן אנו מתארים שיטה יעילה להשגת כמעט בכל רקמות האף ושלמות עם ארגון האנטומי נשמר. שימוש בכלים כירורגיים תחת מיקרוסקופ לנתח, אנחנו ברצף להסיר את עצמות הגולגולת מקיפות את רקמות האף. הליך זה יכול להתבצע בשני ראשי עכבר paraformaldehyde-קבועים וטרי, גזורים עור. הליך פירוק העצמות של כל לוקח בערך 20-30 דקות, שהוא קצר יותר באופן משמעותי מהזמן הנדרש לדה הניסיונית מבוססת כימי הקונבנציונליתהסתיידות. בנוסף, אנו מציגים שיטה קלה כדי להסיר בועות אוויר שנלכדו בין turbinates, שהוא קריטי להשגת חלקים אופקיים או העטרה או sagittal דקים שלמים מהכנת רקמת האף. רקמת האף מוכנה באמצעות השיטה שלנו יכולה לשמש לכל תצפית הר כולו epithelia, כמו גם מורפולוגית, immunocytochemical, רנ&quot;א הכלאה באתרו, ומחקרים פיסיולוגיים, במיוחד במחקרים שבם האזור ספציפית בדיקה והשוואה הן בעלי העניין.

באמצעות שיטה זו, אנו יכולים אמין להשיג רקמת האף כמעט בשלמותה לחלוטין. 2A איור מראה תמונה של דגימה באף מבוגר מראש paraformaldehyde-קבוע. בדגימה זו, כל האיברים ארבעת תת חוש הריח החושי, כולל איבר משרד החינוך, במחיצה, גנגליון Gruneberg, וVNO, הם בשלמותה. כמו כן, epithelia הנשימה ורקמות...

Watch this Scientific Journal Video about An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization at JoVE.com

An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

שיטה ידנית פירוק עצמות אפקטיבית להכין רקמות האף מאוס שלמות עם ארגון האנטומי משומר

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures.  The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, ...

an-effective-manual-deboning-method-to-prepare-intact-mouse-nasal

Research

JoVE Journal

Biology

34.6K Views.  University of Maryland Baltimore County. 

Video: An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

Immunofluorescence שילוב ודגי DNA על 3D-השתמרו גרעיני Interphase לחקר שינויים בארגון גרעיני 3D

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

-Cut ההיברידי: שיטת חתך משופרת עבור דוגמאות רקמות צמח סרבן

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

תא הטרנס-הפנימית המוני הזרקה של תאי גזע עובריים מוביל שיעור גבוה יותר של Chimerism

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. Disruption of OS would lead to keratitis, conjunctivitis or both (keratoconjunctivitis). In experimental animal models with certain genetic modifications or artificial operations, it is useful to examine all parts of the OS epithelial sheet to evaluate relative pathogenetic changes of each part in parallel. However, dissection of OS tissue as a whole without distortion or damage has been challenging, primarily due to the softness and thinness of the OS affixed to physically separate yet movable eyelids and eyeball. Additionally, the deep eye socket formed by the hard skull/orbital bones is fully occupied by the eyeball leaving limited space for operating dissections. As a result, direct dissection of the eyeball with associated OS tissues from the facial side would often lead to tissue damages, especially the palpebral and bulbar conjunctiva. In this protocol, we described a method to remove the skull and orbital bones sequentially from a bisected mouse head, leaving eyelids, ocular surface, lens and retina altogether in one piece. The integrity of the OS sheet was well preserved and could be examined by histology or immunostaining in a single section.

This protocol describes a method for the isolation of the mouse eyeball with eyelid, ocular surface, anterior and posterior segments in relatively intact position.

בידוד של גלגל שלם כדי להשיג רקמת פני השטח העינית אינטגרלי לבדיקה היסטולוגית ואימונוהיסטוכימיה

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise subcellular localization of proteins is thus important for answering many biological questions. The quest for a robust label to identify protein localization combined with adequate cellular preservation and staining has been historically challenging. Recent advances in electron microscopy (EM) imaging have led to the development of many methods and strategies to increase cellular preservation and label target proteins. A relatively new peroxidase-based genetic tag, APEX2, is a promising leader in cloneable EM-active tags. Sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) has also advanced in recent years with the advent of cryofixation by high pressure freezing (HPF) and low-temperature dehydration and staining via freeze substitution (FS). HPF and FS provide excellent preservation of cellular ultrastructure for TEM imaging, second only to direct cryo-imaging of vitreous samples. Here we present a protocol for the cryoAPEX method, which combines the use of the APEX2 tag with HPF and FS. In this protocol, a protein of interest is tagged with APEX2, followed by chemical fixation and the peroxidase reaction. In place of traditional staining and alcohol dehydration at room temperature, the sample is cryofixed and undergoes dehydration and staining at low temperature via FS. Using cryoAPEX, not only can a protein of interest be identified within subcellular compartments, but also additional information can be resolved with respect to its topology within a structurally preserved membrane. We show that this method can provide high enough resolution to decipher protein distribution patterns within an organelle lumen, and to distinguish the compartmentalization of a protein within one organelle in close proximity to other unlabeled organelles. Further, cryoAPEX is procedurally straightforward and amenable to cells grown in tissue culture. It is no more technically challenging than typical cryofixation and freeze substitution methods. CryoAPEX is widely applicable for TEM analysis of any membrane protein that can be genetically tagged.

This protocol describes the cryoAPEX method, in which an APEX2-tagged membrane protein can be localized by transmission electron microscopy within optimally-preserved cell ultrastructure.

שיטת ה-קריואיפקס לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני של לוקליזציה של חלבון ממברנה בתוך תאים שהשתמרו באופן מבנית

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular mechanisms behind the beneficial effects of exercise are poorly understood. Many physical workouts, particularly those classified as aerobic exercises such as jogging and walking, produce impulsive forces at the time of foot contact with the ground. Therefore, it was speculated that mechanical impact might be implicated in how exercise contributes to organismal homeostasis. For testing this hypothesis on the brain, a custom-designed ''passive head motion'' (hereafter referred to as PHM) system was developed that can generate vertical accelerations with controlled and defined magnitudes and modes and reproduce mechanical stimulation that might be applied to the heads of rodents during treadmill running at moderate velocities, a typical intervention to test the effects of exercise in animals. By using this system, it was demonstrated that PHM recapitulates the serotonin (5-hydroxytryptamine, hereafter referred to as 5-HT) receptor subtype 2A (5-HT2A) signaling in the prefrontal cortex (PFC) neurons of mice. This work provides detailed protocols for applying PHM and measuring its resultant mechanical accelerations at rodents' heads.

The present protocol describes a custom-designed ''passive head motion'' system, which reproduces mechanical accelerations at rodents' heads generated during their treadmill running at moderate velocities. It allows dissecting mechanical factors/elements from the beneficial effects of physical exercise.

יישום של תנועת ראש פסיבית ליצירת תאוצות מוגדרות בראשי מכרסמים

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

A Mouse Model of Pulmonary Fibrosis Induced by Nasal Bleomycin Nebulization

Pulmonary fibrosis is characteristic of several human lung diseases that arise from various causes. Given that treatment options are fairly limited, mouse models continue to be an important tool for developing new anti-fibrotic strategies. In this study, intrapulmonary administration of bleomycin (BLM) is carried out by nasal nebulization to create a mouse model of pulmonary fibrosis that closely mimics clinical disease characteristics. C57BL/6 mice received BLM (7 U/mL, 30 min/day) by nasal nebulization for 3 consecutive days and were sacrificed on day 9, 16, or 23 to observe inflammatory and fibrotic changes in lung tissue. Nasal aerosolized BLM directly targeted the lungs, resulting in widespread and uniform lung inflammation and fibrosis. Thus, we successfully generated an experimental mouse model of typical human pulmonary fibrosis. This method could easily be used to study the effects of the administration of various nasal aerosols on lung pathophysiology and validate new anti-inflammatory and anti-fibrotic treatments.

<meta charset="utf8"></head><body>מודל עכבר של פיברוזיס ריאתי המושרה על ידי נבוליזציה של בלומיצין באף

Various animal models of pulmonary fibrosis have been established using bleomycin to clarify the pathogenesis of pulmonary fibrosis and find new drug targets. However, most pulmonary fibrosis models targeting lung tissue have uneven drug administration. Here, we propose a model of uniform pulmonary fibrosis induced by nasal bleomycin nebulization.

מודל עכבר של פיברוזיס ריאתי המושרה על ידי נבוליזציה של בלומיצין באף

Pulmonary fibrosis is characteristic of several human lung diseases that arise from various causes. Given that treatment options are fairly limited, mouse ...

Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy

Metabolism is the basis of important processes in cellular life. Characterizing how metabolic networks function in living tissues provides crucial information for understanding the mechanism of diseases and designing treatments. In this work, we describe procedures and methodologies for studying in-cell metabolic activity in a retrogradely perfused mouse heart in real-time. The heart was isolated in situ,&#160;in conjunction with cardiac arrest to minimize the myocardial ischemia and was perfused inside a nuclear magnetic resonance (NMR) spectrometer. While in the spectrometer and under continuous perfusion, hyperpolarized [1-13C]pyruvate was administered to the heart, and the subsequent hyperpolarized [1-13C]lactate and [13C]bicarbonate production rates served to determine, in real-time, the rates of lactate dehydrogenase and pyruvate dehydrogenase production. This metabolic activity of hyperpolarized [1-13C]pyruvate was quantified with NMR spectroscopy in a model free-manner using the product selective saturating-excitations acquisition approach. 31P spectroscopy was applied in between the hyperpolarized acquisitions to monitor the cardiac energetics and pH. This system is uniquely useful for studying metabolic activity in the healthy and diseased mouse heart.

Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy

We describe an experimental setup for administrating hyperpolarized 13C-labeled metabolites in continuous perfusion mode to an isolated perfused mouse heart. A dedicated 13C-NMR acquisition approach enabled the quantification of metabolic enzyme activity in real-time, and a multiparametric 31P-NMR analysis enabled the determination of the tissue ATP content and pH.