עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר (NIH / 009,269 NIDCD, 012,831 ומענקי NIH תוספת מנהליים ערה) לWeihong לין. תודה מיוחדת למר טים פורד בUMBC לקבלת הסיוע הטכני שלו בצילום וידאו ועיבוד. כמו כן, אנו רוצים להודות לד&quot;ר דפנה בלומברג, גב &#39;Chere פטי בUMBC ומר ניקולס מק&#39; קול מאולימפוס אמריקה בע&quot;מ לסיוע הציוד שלהם בצילום וידאו.

1. הכנת האף מאוס אנחנו השתמשנו בעכברים מבוגרים רקע C57BL / 6 במחקר זה. כל הטיפול בבעלי החיים ובנהלים שאושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים וועדות להשתמש (IACUC) מאוניברסיטת מרילנד, במחוז בולטימור. 1.1 רכישת האף מעכברי paraformaldahyde-קבועים <img src="/files/ftp_upload/50538/50538fig1.jpg" alt="איור 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50538/50538fig1highres.jpg"/> איור 1. עצמות גולגולת של עכבר: A. תצוגה הגבי של הגולגולת ב &#39;:. תצוגת הגחון של הגולגולת עם הלסת התחתונה הוסרה. הגולגולת הייתה מוכנה מעכבר בן 40 יום. עצמות בודדות הן בצבע להדמיה טובה יותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50538/50538fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse transcardially לתקן עכברים בודדים לאחר הדואר הפרוטוקול של לין, et al., (2008) 16. בקצרה, עכברים היו מורדמים עמוק עם tribromoethanol (משקל Avertin 250 מיקרוגרם / g גוף), perfused transcardially עם 0.1M פוספט חיץ (PB, 30-50 מ&quot;ל), ואחריו פוספט שנאגרו מקבע המכיל 3% paraformaldehyde, 19 מ&quot;מ L-ליזין monohydrochloride, ו0.23% נתרן מ-periodate (כ 35-50 מ&quot;ל). אפשר גם לבצע את השלבים במאמר יופיטר לזלוף בעלי החיים 35. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים כדי לחתוך את הלסת התחתונה (או הלסת התחתונה) ולהסיר את העור על הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפריד את הראש מכל שאר הגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החיך. כמו כן, לנקות ולהסיר את רקמת חיבור ושרירים שנותרו על פני השטח של הגולגולת כדי להשיג הדגימה מוצגת ב1A ו-1B דמויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתיחה, להסיר את עצם הגולגולת המכסה את המוח ואת נורות חוש הריח. לקצץ את הרקמות ועצמות עודפים. לאטה, להכנת הרקמה המורחבת שבו המוח והאף נשארים מחובר, רק את עצמות הגולגולת יוסרו. עבור ניסויי immunohistochemical, הרקמות היו שלאחר שנקבעה ל1.5 שעות והועברו ל0.1M פוספט שנאגרו מלוח (PBS) עם 25% סוכרוז בן לילה. רקמת האף צריכה להישמר לאורך humidified הנתיחה על ידי טבילתו בתמיסת סוכרוז נאגר מספר פעמים. </li></ol> 1.2 רכישת האף מעכברים טריים מורדמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים בודדים הועברו לכלוב נקי וחשוף לגז CO 2, שאחריו 5 דקות נקע בצוואר רחם לאחר הנשימה האחרונה. כדי להפחית את הדם ברקמות האף, השתמש במספריים כדי לפתוח את החזה וחתך את הלב כדי לאפשר לדם לניקוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 1.1.2 ל1.1.5, למעט לאחר הקיבוע וcryoprotection עם 25% סוכרוז. הדגימה צריכה להישמר humidified ומתוחזק עם המכיל תמיסת מלח של Tyrode (מ&quot;מ): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 1 CaCl 2, 10 פירובט Na, 10 D-גלוקוז, ו10 N-2-hydroxyethylpiperazine-רוקנ-2-ethanesulfonic חיץ החומצה (HEPES, מותאם ב-pH 7.4). לחלופין, לקפל פיסת Kimwipes, להשרות אותו עם הפתרון של Tyrode, ומקום מתחת לדגימה בזמן לנתח ומדי פעם לטבול את הדגימה בפתרון של Tyrode או להפיל איזה פתרון על הרקמות כדי לשמור אותו humidified כדי לשמור על יכולת הקיום של התאים והרקמות . </li></ol> 2. חותכת, Vomer קדמי והסרת עצם לסת עליונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל מנקודת מבט הגחון. אתר את עצם vomer ולשבור את עצם vomer לאורכו באמצעות מלקחיים או rongeur עם שיניים כדי לשבור את רוב הגחון של העצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים משוננים, להסיר את הקטעים שבורים של עצם vomer בעדינות על ידי משוטטות את שברי העצמות מאיבר יעקובסון (VNO). שימו לב, לעכברים פחות מבן חודש, או אם מעוניין רק במשרד החינוך, אלה שני STEניתן לדלג PS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזק היטב את הראש עם מלקחיים. השתמש rongeur לשבור את החלק הקדמי של שני שיניים חותכות ואזור מפרקים של לסת עליונה קדמית בין שתי השיניים החותכות ועצם vomer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור את החלק הגחוני של הלסת העליונה הימנית באזור רק הקדמי לקשת עד לרמה של צלחת הזיגומטית הגבי הזיגומטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעיף מעל האף לנקודת מבט הגבי. השתמש rongeur לשבור את הלסת העליונה קדמי הימנית של צלחת הזיגומטית הגבי. קדמי הלסת העליונה הימנית של כל צלחת הזיגומטית צריך להיות משוחרר. השתמש במלקחיים העדינים להפריד כל רקמת האף בסיס הלסת העליונה בעדינות, ולאחר מכן בעדינות להרים משם שבר העצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.4 ו 2.5 כדי לשחרר את השן החותכת השמאלית ולסת העליונה קדמית שמאלית ולהסיר אותם לאחר עצם האף הוסר. </li></ol> 3. עצם האף והסרת פלייט הזיגומטית הגבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחיים המשוננים או rongeur מחדשלהעביר את שארית העצמות הקדמיות רק הזנב לעצמות האף. לאחר הסרת פיסת עצם זה, ניתן אחז בחלק הזנב של עצם האף באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש rongeur לשבור את החלק הקדמי של קשת הזיגומטית, אשר מחוברת לצלחת הזיגומטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את המלקחיים העדינים בקצה הלטרלי של סוף הגב של צלחת הזיגומטית והעדינות להעיף את העצם ולהסיר אותו. אם העצם לא רופף, השתמש rongeur כדי לצבוט אותו בעדינות כדי לשחרר אותו להסרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בסכין גילוח מלקחיים או קנס כדי לשחרר את התפר המדיאלי בין עצמות האף הימניות והשמאליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחיים המשוננים לאחוז סוף הזנב של עצם האף הימני. בעדינות להזיז את העצמות מצד לצד כדי להפריד אותו מבסיס רקמות. זה שימושי כדי להעביר את המלקחיים יחד שלישי הזנב של עצם האף להעברה לצד העצם לצד. כמו עצם האף מפריד, לאט להרים את העצם מקצה הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמנם לאהוא עצם האף מעט מורם, הטה את העצם רוחבי לחשוף בליטה לרוחב של העצם שהוא מצופה ברקמת אפיתל נשימה דקה. שימוש במלקחיים בסדר לשחרר רקמה זו בעדינות מעצם האף. תמשיך להרים את עצם האף. כאשר העצם מופרד לחלוטין מהרקמה בסיסית, השתמש במספריים כדי לחתוך את עצם האף בסוף מקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1, 3.5 ו -3.6 להסרת עצם האף שמאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.2 ו -3.3 לצד השמאלי של האף. </li></ol> 4. הסרת פלייט הזיגומטית לרוחב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת צד אחד הזיגומטית בכל פעם. כך או צלחת הזיגומטית ניתן להסיר ראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנקודת מבט הגחון, לשבור את הלסת העליונה נחות קשת הזיגומטית עד הפסקה מגיעה לקשת הזיגומטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנקודת מבט הגבי, בעדינות לתפוס את קשת הזיגומטית ולהרים את קדימה ורוחב. אם צלחת הזיגומטית עדיין מחוברת לכל רקמה, לקחת את הקנסמלקחיים ועדינות לנתק את הקשרים בין הרקמות והעצמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה עבור צלחת הזיגומטית בצד השני של האף. </li></ol> 5. הסרת עצם אורביט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנקודת מבט הגחון, לשבור את עצמות palantine בין הטוחנות של האף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש rongeur לשבור את 3 שיניים טוחנות והלסת עליונה בכל צד של האף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור ולהסיר את כל חתיכות עבות הנותרות של עצם הגחון ואחוריות לturbinates בכל צד של האף. </li></ol> 6. הסרת עצם כברתי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור את כל חלק של העצם כברתי הזנב הבולט לturbinates. זה הכרחי כדי למנוע אובדן של רקמת חלזוני בעת הסרת חתיכות דקות של העצם כברתי מכסות את turbinates. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצדו הימני של החרטום, הנח את המלקחיים העדינים בקצה הקדמי של העצם כברתי בעדינות ולהסיר אותו. אם חלק של העצם נשאר, לחזור על הליך זה עד שכל<html> העצם הדק המכסה את turbinates הוסר. עצמות חלזוני לא צריכים להסיר ברוב של ההכנות. בעכברים בגיל, צלחת cribriform הופכת פריכה. אם יש צורך cryosectioning של רקמות האף, להסיר חתיכות קטנות של הצלחת עם מלקחיים עדינים כדי להפחית את נזק הפוטנציאלי שנגרם על ידי העצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 6.2) לצד השמאלי של האף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא את כל שברי עצמות שנותרו לפני חתך. הערה: בחיות יותר מ, אזור posterodorsal בת של עצם מחץ היא מעט עבה וקשה. אפשר להסיר את החלק הזה באמצעות מלקחיים בסדר. הכנס את הקצה של המלקחיים לצד השני של העצם כדי להפריד את החלק הגבי של עצם מחץ ורקמת האפיתל המצפה. השתמש זוג מלקחיים כדי לתפוס את העצם ולהחזיק את הדגימה. השתמש בזוג נוסף של מלקחיים כדי לשבור את החלק הגרמי העליון מחלק הסחוסים התחתון של מחיצת האף בעדינות ולהסיר אותו. </li></ol>&gt; 7. הכנה לאף cryosectioning <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את משאבת ואקום aspirator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האף בעובש הטבעה. להטביע את האף בתקשורת אוקטובר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בשואב אבק כדי להסיר בועות אוויר שנלכדו בתוך רקמת האף. תהליך זה נמשך עד 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת בועות אוויר, הגדר את הרקמה בכיוון הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את אוקטובר ורקמות בתבנית בעזרת קרח יבש. הרקמה מוטבעת אז יכולה להיות cryosectioned מייד או מאוחסנת ב -80 ° C לשימוש עתידי. </li></ol>

<ol>
	<li>Naclerio, R. M., Pinto, J., Assanasen, P., Baroody, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+ability+of+the+nose+to+warm+and+humidify+inspired+air.">Observations on the ability of the nose to warm and humidify inspired air.</a> Rhinology. 45, 102-111 (2007).</li><li>Bjermer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nose+as+an+air+conditioner+for+the+lower+airways.">The nose as an air conditioner for the lower airways.</a> Allergy. 54, 26-30 (1999).</li><li>Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+olfactory+system+makes+sense+of+scents.">How the olfactory system makes sense of scents.</a> Nature. 413, 211-218 (2001).</li><li>Bryant, B., Silver, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemisthesis: The common chemical sense. , (2000).</li><li>Gross, E. A., Swenberg, J. A., Fields, S., Popp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+morphometry+of+the+nasal+cavity+in+rats+and+mice.">Comparative morphometry of the nasal cavity in rats and mice.</a> J. Anat. 135, 83-88 (1982).</li><li>Halpern, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+and+function+of+the+vomeronasal+system.">The organization and function of the vomeronasal system.</a> Annu. Rev. Neurosci. 10, 325-362 (1987).</li><li>Rodolfo-Masera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Su+l'esquoestizenza+di+un+particulare+organo+olfacttivo+nel+setto+nasale+della+cavia+e+di+altri+roditori.">Su l'esquoestizenza di un particulare organo olfacttivo nel setto nasale della cavia e di altri roditori.</a> Arch. Ital. Anat. Embryol. 48, 157-212 (1943).</li><li>Levai, O., Strotmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projection+pattern+of+nerve+fibers+from+the+septal+organ:+DiI-tracing+studies+with+transgenic+OMP+mice.">Projection pattern of nerve fibers from the septal organ: DiI-tracing studies with transgenic OMP mice.</a> Histochemistry and Cell biology. 120, 483-492 (2003).</li><li>Storan, M. J., Key, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septal+organ+of+Gruneberg+is+part+of+the+olfactory+system.">Septal organ of Gruneberg is part of the olfactory system.</a> J. Comp. Neurol. 494, 834-844 (2006).</li><li>Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+views+on+the+distinct+but+related+roles+of+the+main+and+accessory+olfactory+systems+in+responsiveness+to+chemosensory+signals+in+mice.">Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice.</a> Horm. Behav. 46, 247-256 (2004).</li><li>Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sense+of+smell:+multiple+olfactory+subsystems.">The sense of smell: multiple olfactory subsystems.</a> Cell Mol. Life Sci. 63, 1465-1475 (2006).</li><li>Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsystem+organization+of+the+mammalian+sense+of+smell.">Subsystem organization of the mammalian sense of smell.</a> Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).</li><li>Finger, T. E., St Jeor, V. L., Kinnamon, J. C., Silver, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+substance+P-+and+CGRP-immunoreactive+nerve+fibers+in+the+nasal+epithelium+of+rodents.">Ultrastructure of substance P- and CGRP-immunoreactive nerve fibers in the nasal epithelium of rodents.</a> J. Comp. Neurol. 294, 293-305 (1990).</li><li>Papka, R. E., Matulionis, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+substance-P-immunoreactive+nerves+with+the+murine+olfactory+mucosa.">Association of substance-P-immunoreactive nerves with the murine olfactory mucosa.</a> Cell Tissue Res. 230, 517-525 (1983).</li><li>Baraniuk, J. N., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasonasal+reflexes,+the+nasal+cycle,+and+sneeze.">Nasonasal reflexes, the nasal cycle, and sneeze.</a> Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 105-111 (2007).</li><li>Lin, W., Ogura, T., Margolskee, R. F., Finger, T. E., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM5-expressing+solitary+chemosensory+cells+respond+to+odorous+irritants.">TRPM5-expressing solitary chemosensory cells respond to odorous irritants.</a> J. Neurophysiol. 99, 1451-1460 (2008).</li><li>Ogura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+microvillous+cells+in+the+mouse+main+olfactory+epithelium+and+effect+of+acetylcholine+on+olfactory+sensory+neurons+and+supporting+cells.">Cholinergic microvillous cells in the mouse main olfactory epithelium and effect of acetylcholine on olfactory sensory neurons and supporting cells.</a> J. Neurophysiol. 106, 1274-1287 (2011).</li><li>Finger, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solitary+chemoreceptor+cells+in+the+nasal+cavity+serve+as+sentinels+of+respiration.">Solitary chemoreceptor cells in the nasal cavity serve as sentinels of respiration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8981-8986 (2003).</li><li>Gulbransen, B. D., Clapp, T. R., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+solitary+chemoreceptor+cell+responses+to+bitter+and+trigeminal+stimulants+in+vitro.">Nasal solitary chemoreceptor cell responses to bitter and trigeminal stimulants in vitro.</a> J. Neurophysiol. 99, 2929-2937 (2008).</li><li>Zhao, K., Dalton, P., Yang, G. C., Scherer, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+modeling+of+turbulent+and+laminar+airflow+and+odorant+transport+during+sniffing+in+the+human+and+rat+nose.">Numerical modeling of turbulent and laminar airflow and odorant transport during sniffing in the human and rat nose.</a> Chemical Senses. 31, 107-118 (2006).</li><li>Ressler, K. J., Sullivan, S. L., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zonal+organization+of+odorant+receptor+gene+expression+in+the+olfactory+epithelium.">A zonal organization of odorant receptor gene expression in the olfactory epithelium.</a> Cell. 73, 597-609 (1993).</li><li>Vassar, R., Ngai, J., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+segregation+of+odorant+receptor+expression+in+the+mammalian+olfactory+epithelium.">Spatial segregation of odorant receptor expression in the mammalian olfactory epithelium.</a> Cell. 74, 309-318 (1993).</li><li>Fulle, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+receptor+guanylyl+cyclase+expressed+specifically+in+olfactory+sensory+neurons.">A receptor guanylyl cyclase expressed specifically in olfactory sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 3571-3575 (1995).</li><li>Juilfs, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subset+of+olfactory+neurons+that+selectively+express+cGMP-stimulated+phosphodiesterase+(PDE2)+and+guanylyl+cyclase-D+define+a+unique+olfactory+signal+transduction+pathway.">A subset of olfactory neurons that selectively express cGMP-stimulated phosphodiesterase (PDE2) and guanylyl cyclase-D define a unique olfactory signal transduction pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 3388-3395 (1997).</li><li>Lin, W., Arellano, J., Slotnick, B., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odors+detected+by+mice+deficient+in+cyclic+nucleotide-gated+channel+subunit+A2+stimulate+the+main+olfactory+system.">Odors detected by mice deficient in cyclic nucleotide-gated channel subunit A2 stimulate the main olfactory system.</a> The Journal of Neuroscience: The Official journal of the Society for Neuroscience. 24, 3703-3710 (2004).</li><li>Ishii, T., Omura, M., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+two-+and+three-color+fluorescent+RNA+in+situ+hybridization+of+the+main+and+accessory+olfactory+epithelia+in+mouse.">Protocols for two- and three-color fluorescent RNA in situ hybridization of the main and accessory olfactory epithelia in mouse.</a> J. Neurocyt. 33, 657-669 (2004).</li><li>Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X., Ma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+patterns+of+odorant+receptors+and+response+properties+of+olfactory+sensory+neurons+in+aged+mice.">Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice.</a> Chemical Senses. 34, 695-703 (2009).</li><li>Packard, A., Schnittke, N., Romano, R. A., Sinha, S., Schwob, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeltaNp63+regulates+stem+cell+dynamics+in+the+mammalian+olfactory+epithelium.">DeltaNp63 regulates stem cell dynamics in the mammalian olfactory epithelium.</a> The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 8748-8759 (2011).</li><li>Matthews, J. B., Mason, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+decalcifying+agents+on+immunoreactivity+of+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue.">Influence of decalcifying agents on immunoreactivity of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Histochem J. 16, 771-787 (1984).</li><li>Athanasou, N. A., Quinn, J., Heryet, A., Woods, C. G., McGee, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+decalcification+agents+on+immunoreactivity+of+cellular+antigens.">Effect of decalcification agents on immunoreactivity of cellular antigens.</a> J. Clin. Pathol. 40, 874-878 (1987).</li><li>Hegg, C. C., Irwin, M., Lucero, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+store-mediated+signaling+in+sustentacular+cells+of+the+mouse+olfactory+epithelium.">Calcium store-mediated signaling in sustentacular cells of the mouse olfactory epithelium.</a> Glia. 57, 634-644 (2009).</li><li>Spehr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+the+main+olfactory+system+in+social+recognition+of+major+histocompatibility+complex+peptide+ligands.">Essential role of the main olfactory system in social recognition of major histocompatibility complex peptide ligands.</a> The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 1961-1970 (2006).</li><li>Ma, M., Chen, W. R., Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+rat+and+mouse+olfactory+receptor+neurons+from+an+intact+epithelial+preparation.">Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation.</a> J. Neurosci. Methods. 92, 31-40 (1999).</li><li>Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+responses+of+mouse+olfactory+sensory+neurons+using+the+air-phase+electroolfactogram+recording.">Analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording.</a> J. Vis. Exp. (37), e1850 (2010).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).</li><li>Lin, W., Margolskee, R., Donnert, G., Hell, S. W., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+neurons+expressing+transient+receptor+potential+channel+M5+(TRPM5)+are+involved+in+sensing+semiochemicals.">Olfactory neurons expressing transient receptor potential channel M5 (TRPM5) are involved in sensing semiochemicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2471-2476 (2007).</li><li>Lin, W., Ezekwe, E. A., Zhao, Z., Liman, E. R., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM5-expressing+microvillous+cells+in+the+main+olfactory+epithelium.">TRPM5-expressing microvillous cells in the main olfactory epithelium.</a> BMC Neurosci. 9, 114 (2008).</li><li>Ogura, T., Krosnowski, K., Zhang, L., Bekkerman, M., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoreception+regulates+chemical+access+to+mouse+vomeronasal+organ:+role+of+solitary+chemosensory+cells.">Chemoreception regulates chemical access to mouse vomeronasal organ: role of solitary chemosensory cells.</a> PLoS One. 5, e11924 (2010).</li><li>Sathyanesan, A., Feijoo, A. A., Mehta, S. T., Nimarko, A. F., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profile+of+G-protein+&#946;&#947;+subunit+gene+transcripts+in+the+mouse+olfactory+sensory+epithelia.">Expression profile of G-protein &#946;&#947; subunit gene transcripts in the mouse olfactory sensory epithelia.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 84 (2013).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן, אנו הפגנו הליך צעד אחר צעד לבידוד רקמת הרחה ונשימה ללא פגע מהאף העכבר על ידי רצף הסרת העצמות המקיפות תוך חוסך הרקמה להלן. אנו מראים כי הסרת עצם זהירה יכולה לשמר גם את הרקמות העדינות ביותר בשלמותם. כמו כן, אנו חולקים תובנות שינויים אפשריים של טכניקה זו, שבה אנו מבוד?...

חלל האף היונקים מכיל סוגים שונים של רקמות ואיברים המשרתים פונקציות שונות. חלל האף מהווה חלק כניסתם של דרך הנשימה העליונה, המאפשרת נסיעות אוויר לתוך ומחוץ לריאות. שאיפת אוויר עובר דרך חלל האף שבו הוא עובר טמפרטורה ולחות אוויר 1, כמו גם ניקוי או סינון כדי להסיר חומרים רעילים ומעצבנים ומיקרואורגניזמים זיהומיות 2. שני הטיפולים מבוצעים על ידי האף epithelia ורקמות subepithelial, כולל בלוטות וכלי והנם קריטיים להגנה על דרכי הנשימה התחתונה והריאות. בנוסף לתפקידה בנשימה והגנת אפיתל, רקמות האף מכילה גם מנגנונים תחושתיים היקפיים של מערכות חוש הריח ומשולשות, אשר לזהות מגוון רחב של חומרים כימיים באוויר שעובר. תלוי באיזה מערכת מופעלת, גילוי חושי של כימיקלים באף יכול לעורר אוחוש הריח, גירוי או כאב 3,4. מערכת ההרחה ההיקפית היא מורכבת ומורכב מכמה איברי חישה ריח מופרדים אנטומית בתוך חלל האף. ביניהם, אפיתל ההרחה הראשי (משרד החינוך) הוא הגדול ביותר, המהווה כ 45-52% מepithelia האף במכרסמים 5 והוא ממוקם באזור האחורי. באזור anteroventral, יש זוג מבנים צינוריים המכונים איבר יעקובסון 6, שיושב לאורך כל צד של מחיצת האף. שתי קבוצות נוספות קטנות של עצב סנסורי חוש הריח, המכונות איבר במחיצה של Masera 7,8 וגנגליון Gruneberg 9, מתגורר יחד מחץ הגחון ואזור כניסת הגב של חלל האף, בהתאמה. איברים היקפיים אלה מכילים נוירו epithelia עם מאפיינים בולטים במורפולוגיה, ביטוי תא דה מרקר, ותפקוד פיסיולוגי. יחד הם מזהים אלפי ריחמולקולות עם רגישות מעודנת 10-12. בנוסף לאברי החישה הריח, חלל האף גם בתי מערכות חושיות אחרות. זה ידוע כי סיבי עצב משולש peptidergic נמצאים באפיתל באף, במיוחד אפיתל הנשימה 13,14. חלק מסיבים אלה לזהות כימיקלים רעילים ומעצבנים ואחראי לייזום רפלקסים הגנה כגון שיעול או התעטשות 4,15. יכולות גם להיות מזוהות תרכובות ריחניות ומריר מעצבנת על ידי אוכלוסייה שהתגלתה לאחרונה של תאים בודדים (chemosensory SCCs), שרבים מן מעוצבבים על ידי סיבי עצב משולש 16-19. SCCs אלה ממוקמים בצפיפות גבוהה יותר באזור הכניסה של חלל האף וצינורות הזנת vomeronasal, ורמז כי הם עשויים לשמש גם תפקיד הגנתי 16-18. לפיכך, אף epithelia יכול שונה באופן מהותי בתפקוד, מורפולוגיה, ובהרכב של תאים בהתאם להםמקומות אנטומיים. אפילו בתוך האפיתל יחיד ומיוחד, שיש הבדלים אזוריים. משרד החינוך הוא דוגמה אחת כזו. קווי משרד החינוך turbinates השונים, שהם מסובכים ומסולסלים מבנים. בגללם, אזורים שונים של ספיקות האוויר השונות ניסיון מו, ובכך, דיפוזיה שונה ושיעורי פינוי של מולקולות ריח נישאות באוויר 20. כמו כן, ידוע כי עצב סנסורי חוש הריח (OSNs) מבטא רצפטור ריח נתון נמצאים באחד מארבעת אזורים של לעקוף 21,22 משרד החינוך. איך זה משפיע על הבדל מיקום לא ידועה התגובה של OSN לodorants במידה רבה. בנוסף, חלק מאוכלוסיות OSN מפגינות העדפה אזורית. יש לי OSNs מבטא-Guanylyl cyclase-D (GC-D) הפצות אזוריות העדפת אזורי רחוב ללא מוצא של ectoturbinates 23,24. לאחרונה, מצאנו subpopulation של OSNs הקאנוניים שמבטא ערוץ פוטנציאל רצפטור החולף M5 (TRPM5) והוא ממוקם באזורים מועדף לרוחב וגחון 25. תוצאות אלו מצביעות על משרד החינוך שאינו אחיד. עם זאת, כמה הבדלים אזוריים אלה משפיעים על קידוד חוש הריח אינו מובן. מדובר בין השאר משום שהחקירה פיזיולוגית מעמיקה של משרד החינוך ואף הייתה מוגבלת על ידי קושי בהשגת שלמות באף epithelia עם ארגון האנטומי נשמר באמצעות שיטות קיימות. האף epithelia מוקף בעיקר על ידי העצמות הקדמיות של הגולגולת, כולל האף, הלסת העליונה, הפלטין, הזיגומטית, ועצמות כברתי. בעכברים בוגרים ומודלים של מכרסמים אחרים, העצמות האלה קשות וקשות להסרה מבלי לפגוע ברקמת האף קשורה באופן הדוק, ובמיוחד את turbinates העדין. לעתים קרובות, משמש decalcification מבוסס כימי לריכוך עצמות כדי לאפשר cryosectioning של רקמות האף למורפולוגי, immunohistochemical, ובמחקרי הכלאה באתר, עם זאת, depenדינג בגילו של בעל החיים, התהליך יכול להימשך decalcification הלילה עד 7 ימים 24,26-28. טיפול זה הוא מוגבל גם מכיוון שהיא דורשת להיות רקמה מקבע השתמרה. בנוסף, decalcification הכימי יכול להיות קשה ולהשפיע immunolabeling של כמה נוגדנים רגישים 29,30. למחקרים פיסיולוגיים, נדרשת רקמה חי, ובכך, ניסויים אלה לעתים קרובות נערכים בOSNs מבודד או פרוסות המתקבלות ממשרד חינוך ילודים עצמות גולגולת שלהם הם דקים ורכות 17,31,32. מחקרים פיסיולוגיים יכולים גם לנצל את כל הכנות הר על ידי פיצול ראש 25,33,34, אך בדרך כלל רק המשטח המדיאלי של האף הוא נגיש בקלות, הגבלת הקלטות פיסיולוגיות בתחומים אחרים. כאן, אנו מתארים שיטה יעילה פירוק עצמות, במדריך כדי להכין את רקמות האף שלמות עם השתמר ארגון האנטומי מקורי ומורפולוגיה. אנחנו ברצף להסיר את העצמות הגדולות של קדמייש צורך בגולגולת תחת מיקרוסקופ לנתיחה לחשוף אפיתל האף כמעט בשלמות לחלוטין, תוך שמירה על עצמות חלזוני דקות ללא פגע, אלא אם כן את העכברים הם ישנים מאוד וcryosectioning. אנחנו גם להרחיב את השיטה לשמירה על הקשר בין רקמות האף ונורות חוש הריח, כמו גם את שאר חלקי המוח, ובכך להקל בחינה בו זמנית של שני מעגלים היקפיים והמרכזיים. השיטה שלנו יכולה לשמש להכנת paraformaldehyde-קבוע, כמו גם טרי, רקמות האף חיים. לכן, השיטה שלנו צפויה להקל על מחקרים מורפולוגיים, immunohistochemical ופיסיולוגיים של נשימה, olfaction, ואף נזקים ומחלות.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Dissection&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Rongeur, 1.0 mm Jaw width</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>501333</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps, Dumont 3 </td><td>WPI</td><td>503235</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps, Dumont 55</td><td>WPI</td><td>14099</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps, Dumont AA</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11210-20</td><td></td></tr><tr><td>Specimen forceps, Serrated</td><td>VWR</td><td>82027-440</td><td></td></tr><tr><td>Operating scissors</td><td>WPI</td><td>501753</td><td></td></tr><tr><td>Iris scissors, Straight</td><td>Miltex</td><td>V95-304</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ40</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tissue embedding&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Optimum cutting temperature (OCT) compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Plastic embedding mold</td><td>VWR</td><td>15160-215</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator vacuum pump</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-960-2</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Section staining &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Neutral red</td><td>ACROS Organic</td><td>CAS 553-24-2</td><td>Nuclei staining</td></tr></tbody></table>

an effective manual deboning method to prepare intact mouse nasal tissue with preserved anatomical organization

האף של היונקים הוא איבר רב תפקודי עם מבנים פנימיים מורכבים. חלל האף הוא מצופה epithelia השונים כגון epithelia חוש הריח, נשימה, וקשקש אשר נבדלים במידה ניכרת במקומות אנטומיים, מורפולוגיה, ופונקציות. בעכברים בוגרים, האף מכוסה בעצמות גולגולת שונות, המגביל את הגישה ניסיונית למבנים פנימיים, במיוחד אלה בכזה אחורי כאפיתל ההרחה הראשי (משרד החינוך). כאן אנו מתארים שיטה יעילה להשגת כמעט בכל רקמות האף ושלמות עם ארגון האנטומי נשמר. שימוש בכלים כירורגיים תחת מיקרוסקופ לנתח, אנחנו ברצף להסיר את עצמות הגולגולת מקיפות את רקמות האף. הליך זה יכול להתבצע בשני ראשי עכבר paraformaldehyde-קבועים וטרי, גזורים עור. הליך פירוק העצמות של כל לוקח בערך 20-30 דקות, שהוא קצר יותר באופן משמעותי מהזמן הנדרש לדה הניסיונית מבוססת כימי הקונבנציונליתהסתיידות. בנוסף, אנו מציגים שיטה קלה כדי להסיר בועות אוויר שנלכדו בין turbinates, שהוא קריטי להשגת חלקים אופקיים או העטרה או sagittal דקים שלמים מהכנת רקמת האף. רקמת האף מוכנה באמצעות השיטה שלנו יכולה לשמש לכל תצפית הר כולו epithelia, כמו גם מורפולוגית, immunocytochemical, רנ&quot;א הכלאה באתרו, ומחקרים פיסיולוגיים, במיוחד במחקרים שבם האזור ספציפית בדיקה והשוואה הן בעלי העניין.

באמצעות שיטה זו, אנו יכולים אמין להשיג רקמת האף כמעט בשלמותה לחלוטין. 2A איור מראה תמונה של דגימה באף מבוגר מראש paraformaldehyde-קבוע. בדגימה זו, כל האיברים ארבעת תת חוש הריח החושי, כולל איבר משרד החינוך, במחיצה, גנגליון Gruneberg, וVNO, הם בשלמותה. כמו כן, epithelia הנשימה ורקמות...

Watch this Scientific Journal Video about An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization at JoVE.com

An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

שיטה ידנית פירוק עצמות אפקטיבית להכין רקמות האף מאוס שלמות עם ארגון האנטומי משומר

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures.  The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, ...

an-effective-manual-deboning-method-to-prepare-intact-mouse-nasal

Research

JoVE Journal

Biology

35.3K Views.  University of Maryland Baltimore County. 

Video: An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. The NALT are two parallel bell-shaped structures located in the nasal passages above the hard palate, and are usually considered to be secondary components of the mucosal-associated lymphoid system4-6. Located within the NALT are discrete compartments of B and T lymphocytes interspersed with antigen-presenting dendritic cells4,7,8. These cells are surrounded by an epithelial cell layer intercalated with M-cells that are responsible for antigen retrieval from the mucosal surfaces of the air passages9,10. Naive lymphocytes circulating through the NALT are poised to respond to first encounters with respiratory pathogens7. While NALT disappear in humans by the age of two years, the Waldeyer's Ring and similarly structured lymphatic organs continue to persist throughout life6. In contrast to humans, mice retain NALT throughout life, thus providing a convenient animal model for the study of immune responses originating within the nasal sinuses11.
Cultures of single-cell suspensions of NALT are not practical due to low yields of mononuclear cells. However, NALT biology can be examined by ex vivo culturing of the intact organ, and this method has the additional advantage of maintaining the natural tissue structure. For in vivo studies, genetic knockout models presenting defects limited to NALT are not currently available due to a poor understanding of the developmental pathway. For example, while lymphotoxin-&alpha; knockout mice have atrophied NALT, the Peyer's patches, peripheral lymph nodes, follicular dendritic cells and other lymphoid tissues are also altered in these genetically manipulated mice12,13. As an alternative to gene knockout mice, surgical ablation permanently eliminates NALT from the nasal passage without affecting other tissues. The resulting mouse model has been used to establish relationships between NALT and immune responses to vaccines1,3. Serial collection of serum, saliva, nasal washes and vaginal secretions is necessary for establishing the basis of host responses to vaccination, while immune responses originating directly from NALT can be confirmed by tissue culture. The following procedures outline the surgeries, tissue culture and sample collection necessary to examine local and systemic humoral immune responses to intranasal (IN) vaccination.

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Methods to examine contributions of the nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) to nasal and systemic immune responses of mice to intranasal vaccines are described. We demonstrate a surgical procedure to establish a NALT-dependent mouse model and ex vivo cultures of extracted NALT.

לבחון את תפקידה של רקמות האף והלוע הקשורים Lymphoreticular (NALT) בתגובות עכבר לחיסונים

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

Immunology and Infection

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

הדמיה פרומון חישה ב תכשיר Vomeronasal עכבר רקמות חריפה Slice

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

Neuroscience

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

רקמות הכנה Immunostaining של סיבי עצב תחושתי עכבר Innervating עצמות סקין לימב

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small pieces of tissue, larger specimens like the intact brain pose a problem for immersion fixation because the fixative does not reach all regions of the tissue at the same rate 5,7. Often, changes in response to hypoxia begin before the tissue can be preserved 12. The advantage of directly perfusing fixative through the circulatory system is that the chemical can quickly reach every corner of the organism using the natural vascular network. In order to utilize the circulatory system most effectively, care must be taken to match physiological pressures 3. It is important to note that physiological pressures are dependent on the species used. Techniques for perfusion fixation vary depending on the tissue to be fixed and how the tissue will be processed following fixation. In this video, we describe a low-cost, rapid, controlled and uniform fixation procedure using 4% paraformaldehyde perfused via the vascular system: through the heart of the rat to obtain the best possible preservation of the brain for immunohistochemistry. The main advantage of this technique (vs. gravity-fed systems) is that the circulatory system is utilized most effectively.

Here we describe a low-cost, rapid, controlled and uniform fixation procedure using 4% paraformaldehyde perfused via the vascular system: through the heart of the rat to obtain the best possible preservation of the brain.

בעלי חיים שלמה זלוף קיבוע של מכרסמים

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small ...

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory encoding. LTP elicited in the CA1 region of acute hippocampal slices has been extensively studied. However the molecular mechanisms underlying the maintenance phase of this phenomenon are still poorly understood. This could be partly due to the various experimental conditions used by different laboratories. Indeed, the maintenance phase of LTP is strongly dependent on external parameters like oxygenation, temperature and humidity. It is also dependent on internal parameters like orientation of the slicing plane and slice viability after dissection.
The optimization of all these parameters enables the induction of a very reproducible and very stable long-term potentiation. This methodology offers the possibility to further explore the molecular mechanisms involved in the stable increase in synaptic strength in hippocampal slices. It also highlights the importance of experimental conditions in in vitro investigation of neurophysiological phenomena.

This paper presents a complete methodology to prepare and preserve in vitro acute hippocampal slices from adult mice. This protocol allows the recording of very stable long-lasting long-term potentiation (LTP) for more than 8 hours with a success rate of 95%.

הכנה משופרת ושימור פרוסות עכבר היפוקמפוס להקלטה יציבה מאוד ושחזור של הגברה לטווח ארוך

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo הכנות של הנורה Vomeronasal האיברים ואבזר חוש הריח הפגועה

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.

Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.

הר תיוג כל צילה במערכת חוש הריח העיקרית של עכברים

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

מעמיק פיסיולוגי ניתוח של אוכלוסיות תאים מוגדרות ב אקוטי רקמות פרוסות של איברי עכבר vomeronasal

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Subcellular Fractionation for the Isolation of Synaptic Components from the Murine Brain

Synaptic terminals are the primary sites of neuronal communication. Synaptic dysfunction is a hallmark of many neuropsychiatric and neurological disorders. The characterization of synaptic sub-compartments by biochemical isolation is, therefore, a powerful method to elucidate the molecular bases of synaptic processes, both in health and disease. This protocol describes the isolation of synaptic terminals and synaptic sub-compartments from mouse brains by subcellular fractionation. First, sealed synaptic terminal structures, known as synaptosomes, are isolated following brain tissue homogenization. Synaptosomes are neuronal pre- and post-synaptic compartments with pinched-off and sealed membranes. These structures retain a metabolically active state and are valuable for studying synaptic structure and function. The synaptosomes are then subjected to hypotonic lysis and ultracentrifugation to obtain synaptic sub-compartments enriched for synaptic vesicles, synaptic cytosol, and synaptic plasma membrane. Fraction purity is confirmed by electron microscopy and biochemical enrichment analysis for proteins specific to sub-synaptic compartments. The presented method is a straightforward and valuable tool for studying the structural and functional characteristics of the synapse and the molecular etiology of various brain disorders.

This protocol presents a robust, detailed method to obtain highly pure synaptosomes, synaptic vesicles, and other synaptic fractions from the mouse brain. This method enables the evaluation of synaptic processes, including the biochemical analysis of protein localization and function with compartmental resolution.