פרוטוקול זה משלב RNAscope פלואורסצנטי בהכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה באמצעות תכשירים טריים מוקפאים או קבועים במוח. טכניקה זו מאפשרת גמישות על ידי הדגמת שילוב של הכלאה רגישה מאוד באתרו ושיטות אימונוהיסטוכימיה להדמיה מרחבית של מטרות RNA וחלבון באותה דגימת רקמה. שיטה זו ישימה לתיוג מולטיפלקס בחתך רקמת המוח, ומסייעת לחקור ארגון מרחבי ומשמעות תפקודית של mRNA וחלבונים בתוך אוכלוסיות נוירונים הטרוגניות במדעי המוח.
פרוטוקול זה מתמקד בעיקר בשלבי עיבוד עבור רקמה קפואה טרייה ורקמה קבועה פרפורמלדהיד. כדי להתחיל לחתוך את רקמת המוח הטרייה-קפואה, הצמידו אותה לצ'אק הקריוסטט המצונן מראש וחתכו קטעי קורונל בעובי 14 מיקרומטר. הרכיבו את הקטע על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית טעונה.
העבר את השקופית הטעונה לתוך תיבת שקופיות. לאחר מכן מעבירים את הקופסה למקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס על קרח יבש. עבור קיבוע רקמות, לסנן את הפתרון paraformaldehyde מוכן.
מצננים ל-4 מעלות. הביאו את המגלשה המותקנת מהמקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס על קרח יבש ומיד טבלו אותה בתמיסת הפרפורמלדהיד המצוננת מראש למשך 15 דקות, בצעו התייבשות של רקמה טרייה-קפואה כדי להבטיח שמגלשת הזכוכית יבשה לחלוטין. לאחר הסרת המוח מתושבת קבועה של שפע טרנסקרדילי, באמצעות מיקרוטום רוטט, חתכו קטעי רקמה בעובי 30 מיקרומטר.
אחסן את החלקים החתוכים בתמיסת הגנה קריופרוטקטיבית. ביום בדיקת FISH, העבירו את החלק הצף החופשי לצלחת תרבית תאים בת 12 בארות המכילה PBS טוחנת 0.1 ועוררו אותה במהירות 90 עד 100 סל"ד על שייקר פלטפורמה מסתובב כדי לשטוף את ההגנה הקריואקטיבית. לאחר מכן, באמצעות מברשת צבע, הרכיבו את החלק שטוח על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית כדי למנוע ניתוק במהלך הכביסה, וייבשו באוויר למשך שעתיים לפחות.
באמצעות עט מחסום הידרופובי, צייר מחסום הידרופובי סביב החלק כדי להכיל את ריאגנטים FISH. לאחר עיבוד מקדים, הרקמה מודגרת בתמיסת פרוטאז ועוברת הכלאה עם בדיקות RNAscope למשך שעתיים בהתאם להנחיות היצרן. לאחר מכן, שלבי הגברה רציפים ואימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית מבוצעים.
התחילו בהכנת תא מוגן אור לח לדגירת שקופיות. באמבט מים, יש לחמם את חיץ הכביסה 50X ולבדוק ל-40 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר הקירור לטמפרטורת החדר, הכינו ליטר אחד של חיץ כביסה 1X מריכוז המלאי של 50X.
הכינו את תערובת הגשושית כמתואר בכתב היד של הטקסט. לטיפול בפרוטאינאז, יש להוסיף פרוטאינאז 3 לאזור הרקמה ולדגור עליו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. כדי לשטוף את הפרוטאינאז, טבלו בעדינות את המגלשה ב-PBS טוחנת 0.1 בטמפרטורת החדר, והימנעו מניתוק חלקים.
עבור הכלאה, להוסיף את תערובת הבדיקה על החלק הרקמתי. הניחו אותו בתא לח שחומם מראש. ואז לדגור אותו במשך שעתיים ב 40 מעלות צלזיוס.
שטפו את מקטע הרקמה עם חיץ השטיפה פעמיים במשך שתי דקות. להגברת אותות, באמצעות בקבוק טפטפת, הוסף תמיסת הגברה לכיסוי קטע הרקמה והדגירה כמתואר בטקסט. הוסיפו את התמיסה החוסמת לאזור הרקמה ודגרו במשך שעה בטמפרטורת החדר כדי למנוע קשירה לא ספציפית.
החלק את השקופית כדי להסיר את מאגר החסימה העודף לאחר הדגירה. עכשיו, לדגור את החלק עם נוגדנים ראשוניים לילה ב 4 מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את המגלשה שלוש פעמים עם 1X TBS.
מוסיפים את הנוגדן המשני ודגרים על המקטעים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. בחן את השקופית תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי המצויד במצלמה. רכוש תמונות מייצגות בהגדלה של פי 20 ושמור אותן כקבצי TIF.
במחקר הנוכחי, איכות הרקמה, שלמותה והיעדר זיהום חיידקי אושרו על ידי היעדר תיוג DAPI. תיוג מבדיקות בקרה חיוביות המכוונות ליוביקוויטין C, פפטידילפרוליל איזומראז B ו-RNA פולימראז IIA mRNA אישר את שלמות ה-RNA. בתכשירים טריים מוקפאים כדי להבחין בין נוירונים חיוביים ל-GalR1 mRNA בתוך ה-NTS, נעשה שימוש בסמנים נוירוכימיים נוספים.
הטרנספורטר השלפוחית הקשור לקרום היה מסומן בבירור. לעומת זאת, חלבונים ציטופלזמיים כגון טירוזין הידרוקסילאז ו-GFP המבוטאים תחת הבקרה של מקדם PHOX2B נצפו באופן קלוש ותוארו כפלוקולנטים מכיוון שהם חסרים מתאר ברור. תיוג בדיקת GalR1 FISH של mRNA ציטופלזמי GalR1 היה מנוקב ונצפה בבירור.
כדי לאשר שאיכות האימונוהיסטוכימיה תלויה בלוקליזציה תת-תאית של חלבונים, חלבונים גרעיניים וציטופלזמיים שונים סומנו במקביל ל-FISH באותם חלקי רקמה. הציטופלזמי PHOX2B GFP היה בעל מראה פלוקולנטי. בעוד שהאות הגרעיני של חלבון PHOX2B היה ברור, מה שאישר תיוג חיסוני באיכות גבוהה יותר בשילוב עם FISH.
כאשר בוצע על מקטעים קפואים קבועים בשילוב עם FISH, אימונוהיסטוכימיה הייתה אמינה ללא קשר ללוקליזציה תת-תאית. תאי עצב חיוביים ל-GlyT2 mRNA היו ממוקמים בגחון ל-NTS ולא בתוך ה-NTS. נוירונים מסוג GlyT2 mRNA חיובי ו-PHOX2B mRNA חיובי לא עברו לוקליזציה.
תת-אוכלוסייה של נוירוני NTS חיוביים ל-PHOX2B mRNA הייתה טירוזין הידרוקסילאז אימונוריאקטיבי, ואף אחד מהם לא הכיל GlyT2 mRNA. RNAscope מאפשר הדמיה וניתוח של התפלגות RNA ברזולוציה של מולקולה בודדת בתאים וברקמות. הוא מעצים מחקר במינים חדשים של רנ"א, מנגנוני מחלות, דפוסי ביטוי גנים, מגוון נוירונים ואינטראקציות תאיות.
