כאן, אנו מראים כיצד לבנות תא גירוי חשמלי באמצעות שש צלחות תרבות קיר נפוצות, וכיצד להשתמש בו על מנת לעורר בידול אוסטאוגני בתאי גזע mesenchymal. תא זה קל ולא יקר לבנייה, ו ניתן לעשות בו שימוש חוזר בניסויים מרובים. לאחר שטופלו מראש בגירוי חשמלי בתא שלנו, ניתן להשתמש בתאי גזע קסנצ'ימליים כדי לשפר את התוצאות בטיפולים בהנדסת רקמת עצם.
תא זה יכול לשמש גם כדי לחקור סוגי תאים אחרים והתנהגויות תאים רגישים אלקטרו כמו הגירה, התפשטות, שינויים בפוטנציאל הממברנה, אפופטוזיס, ו התקשרות זהירה. במכסה צלחת שש באר, לסמן ולאחר מכן לקדוח שני חורים בקוטר מילימטר אחד, 25 מילימטרים זה מזה, ליד הקצה החיצוני של כל אחת משש בארות. לאחר מכן, חותכים חוט פלטינה לחלקים באורך 125 ס"מ.
כופפו ידנית כל קטע באורך חמישה סנטימטרים לצורת L, והשאירו קצה אחד באורך שלושה סנטימטרים, ואת שני סנטימטרים נוספים. לאחר מכן, חותכים את החוט מצופה הכסף לשני אורכי 35 ס"מ. הכנס את הקצה הכפוף הארוך יותר של חוט פלטינה לתוך החור שנקדח, והשאיר אחד עד שני מילימטרים בולטים מהחוץ של המכסה.
לכופף אותו באמצעות מדפים. לאחר מכן, לאבטח את חוטי הפלטינה בחורי המכסה עם דבק מוליך סופר ולהשאיר אותם להתייבש במשך כשש שעות. כדי להכין את הקתודות, הלחים את קצות כל ששת חוטי הפלטינה הבולטים מהמכסה לאחד החוטים מצופים הכסף.
כדי להכין את האנודות, הלחים את ששת חוטי הפלטינה הנותרים לחוטים אחרים מצופים כסף. לאחר מכן, להוסיף נוריות במעגל בין כל אחד מששת זוגות אנודה-קתודה פלטינה אלקטרודה כדי לאשר את הפונקציונליות. מניחים פיסת סרט בידוד שחור מתחת לכל LED כדי למנוע חשיפת התאים בצלחות התרבות לאור LED.
לאחר מכן, הדבק את מחבר בלוק מסוף החוט לפינה השמאלית העליונה של מכסה הלוח בן ששת הבארים, וחבר את שני החוטים מצופים הכסף למסופי הקלט. לאחר מכן, לגזור 20 מילימטר על ידי 20 מילימטר מרובע קטע מהפינה השמאלית העליונה של מכסה צלחת שש באר השני, כדי להתאים את מחבר בלוק מסוף על המכסה הראשון. מכסים את המכסה הראשון, מצויד באלקטרודות, עם המכסה השני, וקלטת אותם יחד עם סרט דבק.
חבר קצה אחד של שני חוטי הנחושת המבודדים הסטנדרטיים למסופי הפלט של מחבר התיל, והשני מסתיים במחברים זכרי בננה. הפעל את ספק הכוח על-ידי לחיצה על לחצן כיבוי בלוח הקדמי. הפעל את ערוץ 1 על-ידי לחיצה על לחצן אחד.
לאחר מכן, לחץ על כפתור ארבע כדי להגדיר את המתח. הגדר את פלט העומס על 2.5 וולט. לאחר מכן הקש Enter.
ביום שבו התאים מטופלים בגזע E, מעקרים את האלקטרודות בתסכול 70%אתנול למשך 30 דקות. לאחר מכן, ייבשו אותם תחת אור UV בארון בטיחות למשך 30 דקות נוספות. במכסה המנוע של זרימה למינארית, מכסים את לוח שש הבאר המכיל את ה- MSCs התרבותיים עם המכסה המצויד באלקטרודות, ומוודאים כי האלקטרודות שקועות לחלוטין במדיום.
לאחר מכן, להעביר את צלחת שש באר מכוסה עם תאים לאנקובטור ולחבר את החוטים שלה לאספקת החשמל. לאחר מכן, הגדר את אספקת החשמל לתפוקת עומס של 2.5 וולט וטפל בתאים עם גזע E למשך שעה אחת. לאחר הגירוי, לנתק את אספקת החשמל ולהסיר את תא גזע E מהאינקובטור.
בתנאים סטריליים, החליפו את המכסה, המצויד באלקטרודות, במכסה לוח סטנדרטי של שש בארות. לאחר מכן, להחזיר את התאים לאנקובטור, ולהשאיר אותם לילה. נקה את האלקטרודות, תחילה עם PBS, ולאחר מכן עם 70%פתרון אתנול.
לאחר מכן, לנקות את מוצרי קורוזיה שנצברו מפני השטח אלקטרודה עם נייר זכוכית עדין. חזור על הטיפול בגזע E במשך שישה ימים רצופים. ביום הרביעי, לפני החלת גירוי חשמלי, ובתנאים סטריליים, לשנות את מדיום התרבות על ידי שאיפה 1.5 מיליליטר של בינוני והחלפתו עם 1.5 מיליליטר של מדיום בידול אוסטאוגני מחומם מראש, טרי.
לאחר החלת גירוי חשמלי במשך שבעה ימים רצופים, לשמור על התאים בתרבות במשך שבעה ימים נוספים, החלפת המדיום כל שלושה עד ארבעה ימים. כאשר הטיפול הושלם, לנתח את השינויים מורפולוגיה התא תחת מיקרוסקופ. כדי להעריך את ההשפעה של גירוי חשמלי על בידול אוסטאוגני MSC, למדוד תצהיר סידן, פעילות phosphatase אלקליין, ביטוי גנים סמן osteogenic, כמתואר במקומות אחרים.
כדי להעריך את ההשפעה של 100 מילי-וולט למילימטר של גירוי חשמלי על ההתברלות האוסטאוגנית MSC, תאים שטופלו בגירוי חשמלי במשך שלושה, שבעה ו -14 ימים ותאים שאינם מטופלים, נותחו ביום 14 של התרבות על ידי הערכת שינויים מורפולוגיים ותצהיר סידן. שינויים משמעותיים במורפולוגיה של התאים ובפיקדונות הסידן נראו בתאים שטופלו בגירוי חשמלי במשך שבעה ו-14 ימים. ניתוח מפורט של שינויים בביטוי גנים של סמן אוסטאוגני בוצע בימים 3, 7 ו-14 של תרבות.
ביום השביעי לתרבות, הביטוי RunX2 היה גבוה משמעותית בתאים שטופלו בגירוי חשמלי במשך שבעה ימים. בעוד ביטוי Colla1 היה גבוה משמעותית בתאים שטופלו במשך שבעה ימים, נמדד ביום 14 של התרבות. הביטוי של אוסטאופונטין גדל באופן משמעותי בתאים מגורה חשמלית בימים שלוש, שבע, ו 14 של תרבות.
ביטוי אוסטריקס נעדר בתאי בקרה בכל נקודות הזמן, ונראינו רק בשבעה ו -14 ימים של תרבות בתאים שנחשפו לגירוי חשמלי. תא הגירוי החשמלי קל יחסית לבנייה. עם זאת, יש לדאוג במיוחד בעת טיפול בחוילי הפלטינה, וגם בעת ניקוי ועיקור האלקטרודות.
תאים שטופלו מראש בחשמל בתא שלנו, לבד או יושבים על חומר פיגומים, יכולים להיות מושתלים במודלים של בעלי חיים, כדי לחקור כיצד ההשפעה החיובית של גירוי חשמלי נמשכת במבחנה. טכניקה זו מספקת כלי פשוט אך רב עוצמה ללמוד את המנגנון שבאמצעותו גירוי חשמלי מווסת את תפקודי התאים. ידע זה יכול להיות זמין בתאי רפואה רגנרטיבית.
