המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק לנו רזולוציה אלקטרומיקרוסקופית של חלוקת המים בסוגים שונים של תאים xylem במקום. שיטה זו שימשה להתבוננות במים בקסים על מנת להבהיר את חלוקת המים ומשטרי המים המשתנים, את השונות העונתית של חלוקת המים, את השפעת מחזורי ההקפאה/ההפשרה, את חלוקת המים בעץ רטוב ואת cavitation הנגרמת על ידי לחצים ביוטיים מסוימים. הקפאה-קיבעון של גזע חי תחת מתחים הידראוליים גבוהים לפעמים גורם cavitations מלאכותי, אשר נצפו על ידי cryo-SEM כמו גבישי קרח קרועים בלומן של צינור.
הליך מעודכן זה מתמקד בהשגת מיקרוגרפים אווירוטום באיכות גבוהה של xylem ללא החפץ בהליך הדגימה. הדגמה בת קיימא היא קריטית מכיוון שיש מספר פרטים חשובים שלא ניתן להסביר בקלות. יחד עם זאת, קבלת הכשרה אינה קלה כי רק כמה מעבדות ברחבי העולם לתרגל שיטה זו.
כדי להתחיל בהליך זה, יש להקיף ענף ועלים לדגימה בשקית ניילון שחורה כדי לצייד את פוטנציאל המים בין קסלם לעלים יותר משעה לפני הדגימה. באמצעות תא לחץ, לקבוע את פוטנציאל המים של לפחות שני עלים מהדגימה. כאשר פוטנציאל המים גבוה יותר ממינוס 0.5 מגה פסקל, ניתן לקצור דגימה לאחר ההקפאה.
כאשר פוטנציאל המים נמוך ממינוס 0.5 מגה פסקל, להמשיך עם הטיפול עבור הרפיה. לתקן צווארון אטום למים סביב הגבעול, אשר יהיה מלא במים. באמצעות גיזום גיזום או מסור, לחתוך את הגבעול מתחת לפני המים ולשמור על הקצה החתך של המדגם מתחת למים.
מעבירים את הדגימה למכל מים אחר במהירות האפשרית כדי למזער את חשיפת הקצה החתך לאוויר. עבור מינים בעלי עלים רחבים, ודא כי האורך מהנקודה שבה דגימת קריו עבור SEM תושג לקצה החתך של הגבעול שנקטף ארוך יותר מאורך הכלי המרבי של המדגם על מנת למנוע ממצאים הנגרמים על ידי מתח בתוך crysoample. לאחר מכן, מכסים את הדגימה בשקית ניילון שחורה כדי להפחית את התרחשותה.
שמור על הקצה החתך של המדגם במים ולשמור על מצב זה במשך כ 30 דקות על מנת להרגיע את המתח xylem. לאחר מכן, למדוד את פוטנציאל המים שוב כדי לאשר את הרפיה של המתח xylem. ראשית, השתמש במספריים או בסכין שירות כדי לחתוך ולפתוח צד אחד של צווארון הדוק למים.
חבר את הצווארון בחוזקה סביב הגבעול עם סרט דבק תוך החזקת הצמצם אופקית. לשים על כפפות בידוד, בבטחה להחזיק את כלי החנקן הנוזלי. הפעל חנקן נוזלי לתוך הצווארון עד שהוא מלא ולשמור אותו מלא על ידי הוספת בהתמדה חנקן נוזלי נוסף כדי להקפיא לחלוטין את המים בקסילם.
לאחר זמן הקפאה מספיק, לנתק את הצווארון מן החלק הקפוא של גזע המדגם על מנת להסיר את החנקן הנוזלי. מיד להשתמש ביד יפה מסור כדי לקצור את הדגימה. ואז לכסות את המדגם הקפוא עם חתיכת רדיד אלומיניום או לשים אותו בחזרה לתוך צינור מדגם.
מניחים במהירות את הדגימה שנקטפו לתוך מיכל מלא חנקן נוזלי. לאחסן את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד מוכן לבצע את התצפית. כדי להתחיל, להגדיר את הטמפרטורה של תא הדגימה של cryostat למינוס 30 מעלות צלזיוס, אשר בדרך כלל קר מספיק כדי לשמור על sap xylem של רוב הצמחים במצב קפוא.
השתמש בסכין חדה או במסור דק כדי לקצץ את הדגימה לחתיכה קטנה שניתן להתאים למחזיק הדגימה של cryo-SEM. הר את החתיכה הגזוצה לצ'אק, מחזיק להקפאת קריוסטט, עם מדיום הטבעה המקפיא רקמות לחיתוך קריו. חבר את הצ'אק למחזיק דגימה של מיקרוטום של ההקפאה.
חותכים את פני השטח על ידי גילוח חוזר ונשנה של חמישה עד שבעה חלקים בעובי מיקרומטר. חיתוך יותר מ-1,000 עד 2,000 מיקרומטר בעומק כולל לפני השטח ההתחלתיים שימושי להדגשת החלק הפגום של המדגם שנגרם על ידי חיתוך מראש. לאחר גיזום גס של משטח הדגימה, התאימו חלק לא שימוש של להב המיקרוטום מעל פני השטח של הדגימה.
הרחב מעט את המרחק בין פני השטח של הדגימה לבין הלהב. וחותכים את פני השטח רק פעם או פעמיים. לאחר מכן, החלק שוב את הלהב והצב חלק לא שימוש של הלהב על משטח הדגימה.
חזור על עיבוד חיתוך זה שלוש עד ארבע פעמים כדי להשיג משטח ברור ללא סימני סכין. לאחר החתך הסופי, הגדר את מיקום הלהב הרחק מהדגימה כדי למנוע מאבק להידבק לדגימה. ותנתק את הצ'אק מהמיקרוטום.
לאחר מכן, חבר את הדגימה למחזיק דגימת קריו-SEM עם מדיום הטבעה המקפיא רקמות בתא ההקפאה. ראשית, השתמש בחנקן נוזלי כדי לשמור על טמפרטורה מתחת למינוס 120 צלזיוס בתא הדגימה cryo-SEM על פי המדריך למשתמש הציוד. לאחר מכן, מניחים את מחזיק הדגימה עם הדגימה המוכנה לתוך מיכל בידוד מלא חנקן נוזלי בתא ההקפאה.
השתמש במוט החלפת דגימה כדי להחזיק את מחזיק הדגימה מתחת לחנקן הנוזלי. העבר במהירות את בעל הדגימה לתא טרום הפינוי של חדר הדגימה cryo-SEM ברגע שמתחילים בפינוי של חדר טרום הפינוי. כדי להתחיל, הפעל את מתח התאוצה של האקדח החשמלי.
לאחר מכן, להעלות את הטמפרטורה של שלב הדגימה למינוס 100 מעלות צלזיוס. המתן מספר דקות עד שאבק הכפור יוסר ושרמת פני השטח של הקרח בתאי הקסים תרד מעט בהשוואה לקירות התא. לאחר מכן, להוריד את הטמפרטורה של שלב speiumen למינוס 120 מעלות צלזיוס.
במחקר זה, שיטות תצפית cryo-SEM משמשים כדי לדמיין בבירור את חלוקת המים בקנה מידה תאי. בהגדלה נמוכה, האזור השחור בתמונות מציין את החללים שממנו נעלמים מים לחלוטין או בחלקם, בעוד שהאזור האפור מציין קירות תא קסילם, ציטופלסמה ומים. בהגדלה גבוהה, מתברר כי המים אינם אבודים לחלוטין מן הלומינה של שלוש קנה, המציין את התרחשותן של בועות מאקרו בסאפ xylem במקום.
ביחס למינים בעלי עלים רחבים, התרחשות cavitation מזוהה בקלות בתוך כלי, בעוד קיומו של מים קשה להבחין בתוך סיבים, במיוחד בהגדלה נמוכה. ניתן להבדיל בין תאי ציטופלסמה ופרנצ'ימה לבין מים בתוך קנה ים או כלי שיט באמצעות מרקמי מישור קרח. ניתוח השפעת הטמפרטורה על תהליך תחריט ההקפאה מגלה כי אבק כפור סובלימציה בהדרגה, קרום בור אנדוטרקהיד מתבהר באמצעות התקדמות סובלימציה עם עליית הטמפרטורה.
חלקיקי אבק כפור גדולים שנותרו יכולים להיות מסולקים על ידי הקפאת תחריט נוסף. אבל זה יכול להיות בעייתי כפי שהוא שלא לצורך מקטין את פני השטח של קרח בתעלות xylem. איכות התצפית הגבוהה מושגת במידה רבה באמצעות הכנת דגימה מדויקת.
החלקת פני השטח עם הלהב החד של המיקרוטום חשובה במיוחד. החלקה לא מספקת על-ידי להב משומש יכולה לעיתים ליצור משטח מחוספס הדומה ל סימני סכין, או ליצור מופעים רבים של אבק מהחתכים. הקפאת מדגם ללא הרפיה של לחץ עמוד מים שלילי יגרום אינדוקציה חפץ של cavitation בצינורות xylem.
גבישי קרח מקובצים נצפו בכלי דגימה שבהם המדגם לא היה רגוע. לעומת זאת, לא נצפו גבישי קרח מקובצים בדגימות המדגם הנינוחות עם פוטנציאל מים דומה. היישום של קיבוע הקפאה לצמחים חיים הסובלים מבצורת עלול לגרום לחפצים מבוססי תוצאה כגון גבישי קרח מקובצים באשכולות.
החפצים האלה מובילים לפירוט מוטעה של מצב המים בצינור קסלם. לכן חשוב לאשר תחילה את פוטנציאל המים של דגימות לפני הקפאת קיבעון. למרות שהליך זה מספק תמונה של מה מצב בצינור xylem, עץ חי חייב להיהרס לתצפית.
שילוב שיטות תצפית לא פולשניות אחרות כגון MRI או מיקרו-CT עם תצפית תמונה ברמת חברת הבת יעמיק את הבנתנו את הטבע בין הובלת מים לשימוש. התצפית על מצב המים שהוצגה על ידי נייר זה תספק גם שיטה לבירור הקשר של מים המעורבים בתאים ותגובות אנטומיות אחרות ללחץ אביוטי או ביוטי. Cryo-SEM מצויד בספקטרוסקופיית רנטגן פיזור אנרגיה או סים העליון שימשו לחקר הפצת אלמנטים על פני השטח של דגימה המכילה מים.
שילוב של ניתוח יסודי והליך זה במסגרת דומה זו יכול לתת לנו ידע מעמיק על התנהגות התא הקסילם הקשורה למצב המים. בעת שימוש בחנקן נוזלי להקפאת קיבוע דגימות בחדר, אל תשכח לאוורר את החדר כדי למנוע מחסור בחמצן.
