이 프로토콜의 전반적인 목표는 우리에 게 전자 현미경 해상도 는 situ에서 자일렘 세포의 다양 한 종류에 물 분포의 해상도. 이 방법은 물 분포와 변화하는 물 정권, 물 분포의 계절적 변화, 동결/해동 주기의 효과, 습식 목재의 물 분포 및 특정 생물학적 스트레스에 의해 유도된 캐비테이션을 명확히 하기 위해 자일렘으로 물을 관찰하는 데 사용되어 왔다. 높은 유압 장력 하에서 살아있는 트렁크의 고정은 때때로 인공 캐비테이션을 발생, 이는 도관의 루멘에서 파열 된 얼음 결정으로 냉동 SEM에 의해 관찰된다.
이 업데이트 된 절차는 샘플링 절차에서 아티팩트없이 자일렘의 고품질 의 항공 우주 현미경 그래프를 얻는 데 중점을 둡니다. 쉽게 설명 할 수없는 중요한 세부 사항이 많기 때문에 실행 가능한 데모는 매우 중요합니다. 동시에, 훈련을 얻는 것은 전 세계의 몇몇 실험실만이이 방법을 연습하기 때문에 쉽지 않습니다.
이 절차를 시작하려면 검은 색 비닐 봉지로 샘플링을 위해 가지와 잎을 둘러싸서 자일렘과 샘플링 2 시간 이상 남깁니다. 압력 챔버를 사용하여 샘플에서 적어도 두 잎의 물 전위를 결정합니다. 물 전위가 약 0.5 메가파스칼보다 높을 때, 샘플을 동결 후 수확할 수 있다.
물 전위가 마이너스 0.5 메가파스칼보다 낮을 때, 이완치료를 진행한다. 물로 채워질 줄기 주위에 방수 칼라를 고정합니다. 가지 치기 가위 또는 톱을 사용하여 수면 아래에서 줄기를 자르고 샘플의 절단 끝을 수중으로 유지하십시오.
샘플을 가능한 한 빨리 다른 물 용기로 옮기면 절단 끝이 공기에 노출되는 것을 최소화합니다. 활엽종의 경우, 극저온 내에 장력 유도된 유물을 방지하기 위해 수확된 줄기의 절단 가장자리까지 SEM에 대한 냉동고 샘플이 수득되는 지점에서 길이가 샘플의 최대 용기 길이보다 길다는 것을 확인하십시오. 다음으로 샘플을 검은 색 비닐 봉지로 덮어 발생을 줄입니다.
자일렘 장력을 이완시키기 위해 시료의 절단 끝을 물에 유지하고 약 30 분 동안이 상태를 유지하십시오. 그 후, 자일렘 장력의 이완을 확인하기 위해 다시 물 전위를 측정한다. 먼저 가위나 유틸리티 나이프를 사용하여 물가밀칼라의 한쪽을 자르고 엽니다.
조리개를 수평으로 유지하면서 접착제 테이프로 줄기 주위에 칼라를 단단히 부착하십시오. 절연 장갑을 착용하고 액체 질소의 용기를 안전하게 보관하십시오. 액체 질소가 가득 차때까지 칼라에 넣고 자일렘의 물을 완전히 동결하기 위해 액체 질소를 꾸준히 추가하여 채우십시오.
충분한 동결 시간 후, 액체 질소를 제거하기 위해 샘플 줄기의 냉동 부분에서 칼라를 분리한다. 즉시 미세 한 손 톱을 사용하여 샘플을 수확하십시오. 그런 다음 냉동 샘플을 알루미늄 호일로 덮거나 샘플 튜브에 다시 넣습니다.
수확한 샘플을 액체 질소로 채워진 용기에 빠르게 넣습니다. 관찰을 수행할 준비가 될 때까지 샘플을 영하 80도에서 저장합니다. 시작하려면, 냉동 상태에서 대부분의 식물의 자일렘 수액을 유지하기에 충분히 추운 영하 30도 극저온의 표본 챔버의 온도를 설정합니다.
날카로운 칼이나 미세톱을 사용하여 샘플을 극저온-SEM의 시편 홀더에 맞게 조정할 수 있는 작은 조각으로 다듬어보도록 한다. 다듬어진 조각을 극저온 홀더인 척에 장착하고, 극저온 단면에 티슈 동결 포함 배지를 장착합니다. 척을 극저온의 미세절의 표본 홀더에 부착합니다.
5~7마이크로미터 두께의 단면을 반복적으로 면도하여 표면을 다듬습니다. 초기 표면에 대한 총 깊이1, 000 내지 2, 000 마이크로미터 이상 절단하는 것은 사전 절단으로 인한 시료의 손상된 부분을 용인시키는 데 유용하다. 시료의 표면을 대략 트리밍한 후, 시편 표면 위에 마이크로톤 블레이드의 사용하지 않은 부분을 조정합니다.
시편표면과 블레이드 사이의 거리를 약간 넓어진다. 그리고 표면을 한두 번만 자른다. 그런 다음 블레이드를 다시 밀어 서 칼날의 사용하지 않은 부분을 시편 표면에 배치합니다.
이 절단 처리를 3~4회 반복하여 칼 자국이 없는 맑은 표면을 얻습니다. 마지막 절단 후, 먼지가 샘플에 달라붙지 않도록 샘플에서 멀리 떨어진 블레이드의 위치를 설정합니다. 그리고 마이크로 토메에서 척을 분리합니다.
다음으로, 저온-SEM 표본 홀더에 저온-SEM 표본 홀더에 저온-SEM 표본 홀더에 저온체 챔버에 조직 동결 포함 배지를 부착한다. 첫째, 장비 사용자의 매뉴얼에 따라 냉동-SEM 표본 챔버에서 영하 120°C 이하의 온도를 유지하기 위해 액체 질소를 사용합니다. 다음으로, 준비된 표본을 가진 표본 홀더를 저온챔버에 액체 질소로 채워진 절연 용기에 넣습니다.
막대를 교환하는 표본을 사용하여 액체 질소 아래에 시편 홀더를 잡습니다. 시편 홀더를 냉동-SEM 표본챔버의 사전 피난실로 신속하게 이송하여 피난 전 챔버의 대피를 시작한다. 먼저 전기건의 가속 전압을 켭니다.
다음으로, 표본 단계의 온도를 영하 100도까지 올립니다. 서리 먼지가 제거되고 자일렘 세포의 얼음 표면 수준이 세포벽에 비해 약간 감소할 때까지 몇 분 정도 기다립니다. 그런 다음 스페우미엔 스테이지의 온도를 섭씨 영하 120도로 낮춥습니다.
이 연구에서는 극저온-SEM 관측 방법이 세포 척도에서 물 분포를 명확하게 시각화하는 데 사용됩니다. 낮은 배율에서 이미지의 검은 색 영역은 물이 완전히 또는 부분적으로 사라지는 구멍을 나타내고 회색 영역은 자일렘 세포벽, 세포질 및 물을 나타냅니다. 높은 배율에서, 물이 완전히 세 기관의 루미나에서 손실되지 않는 것이 명백해진다, 현장에서 자일렘 수액에 매크로 거품의 발생을 나타내는.
넓은 잎 종에 관해서는, 캐비테이션 발생은 선박 내에서 쉽게 감지되며, 물 존재는 섬유 내에서 구별하기 어렵고, 특히 낮은 배율에서 구별하기 가 어렵습니다. 세포질과 빈혈세포는 얼음 비행기 질감을 통해 기관이나 혈관 내의 물과 구별될 수 있습니다. 동결 에칭 공정에 대한 온도의 효과를 분석한 결과, 서리 먼지가 점차 승화되고, 내세피 구덩이 막은 온도가 증가함에 따라 승화의 진행을 통해 더 명확해진다.
남은 큰 서리 먼지 입자는 추가 동결 에칭에 의해 제거 될 수있다. 그러나 자일렘 도관의 얼음 표면 수준을 불필요하게 감소시킬 때 문제가 될 수 있습니다. 높은 수준의 관찰은 대체로 정확한 시편 준비를 통해 달성됩니다.
마이크로톤의 날카로운 블레이드로 표면의 스무딩은 특히 중요합니다. 사용된 블레이드에 의한 스무딩이 부족하면 때로는 칼 자국과 유사한 거친 표면을 만들거나 상처에서 수많은 먼지가 발생할 수 있습니다. 음의 물 기둥 압력의 이완없이 샘플 동결은 자일렘 도관에서 캐비테이션의 관절 유도를 일으킬 것이다.
클러스터된 얼음 결정은 시료가 완화되지 않은 시편 용기에서 관찰됩니다. 대조적으로, 유사한 물 잠재력을 가진 편안한 견본에서 클러스터된 얼음 결정은 관찰되지 않습니다. 가뭄을 겪고있는 살아있는 식물을 발생에 동결 고정의 응용 프로그램은 클러스터 된 얼음 결정과 같은 결과 기반 유물을 유도 할 수 있습니다.
이러한 유물은 자일렘 도관의 물 상태를 오해합니다. 따라서 동결 고정 전에 먼저 시료의 물 전위를 확인하는 것이 중요합니다. 이 절차는 자일렘 도관의 상태를 이미지로 제공하지만 관찰을 위해 살아있는 나무를 파괴해야합니다.
MRI 또는 micro-CT와 같은 다른 비침습적 관찰 방법과 자회사 수준의 이미지 관찰을 결합하면 물 운송과 사용 사이의 특성에 대한 이해가 깊어질 것입니다. 이 논문에 의해 도입된 수분 상태의 관찰은 또한 세포및 생물학적 또는 생물학적 스트레스에 대한 다른 해부학적 반응에서 혼합되는 물의 관계의 명확화를 위한 방법을 제공할 것이다. 에너지 분산 X선 분광법 또는 상단 시뮬레이션을 탑재한 Cryo-SEM은 물을 함유한 시편의 표면을 통해 원소 분포를 연구하는 데 사용되었습니다.
원소 분석과 이 절차를 유사한 프레임에 결합하면 물 상태와 관련된 자일렘 세포 행동에 대한 심오한 지식을 제공할 수 있습니다. 실내에서 시료를 동결 고정하기 위해 액체 질소를 사용하는 경우 산소 결핍을 피하기 위해 방을 환기시키는 것을 잊지 마십시오.
