O objetivo geral deste protocolo é fornecer-nos a resolução de eletromicroscopia da distribuição de água em vários tipos de células xilema in situ. Este método tem sido utilizado para observar a água em xilema, a fim de esclarecer a distribuição de água e os regimes de água em mudança, a variação sazonal da distribuição de água, o efeito dos ciclos de congelamento/degelo, a distribuição de água em madeira molhada e a cavitação induzida por certos estresses bióticos. A fixação congelante de um tronco vivo sob altas tensões hidráulicas às vezes causa cavitações artificiais, que são observadas por crio-SEM como cristais de gelo rompidos no lúmen do conduíte.
Este procedimento atualizado se concentra na obtenção de micrografias de aerotome de alta qualidade de xilema sem o artefato no procedimento amostral. A demonstração viável é crítica porque há uma série de detalhes importantes que não podem ser facilmente explicados. Ao mesmo tempo, obter treinamento não é fácil porque apenas alguns laboratórios ao redor do mundo praticam esse método.
Para iniciar este procedimento, inclua um galho e deixe para amostragem com um saco plástico preto para equilibrar o potencial hídrico entre xilema e folhas mais de duas horas antes da amostragem. Usando uma câmara de pressão, determine o potencial de água de pelo menos duas folhas da amostra. Quando o potencial hídrico é maior do que aproximadamente menos 0,5 megapascals, uma amostra pode ser colhida após o congelamento.
Quando o potencial hídrico for menor que menos 0,5 megapascals, proceda com o tratamento para relaxamento. Fixar uma coleira impermeável ao redor da haste, que será preenchida com água. Usando tesouras de poda ou uma serra, corte o caule sob a superfície da água e mantenha a extremidade cortada da amostra debaixo d'água.
Transfira a amostra para outro recipiente de água o mais rápido possível para minimizar a exposição da extremidade do corte ao ar. Para espécies de larga licença, certifique-se de que o comprimento do local onde a amostra de crio para SEM será obtida na borda cortada do caule colhido é maior do que o comprimento máximo do vaso da amostra, a fim de evitar artefatos induzidos pela tensão dentro do crisoample. Em seguida, cubra a amostra com um saco plástico preto para reduzir a transpiração.
Mantenha a extremidade cortada da amostra na água e mantenha essa condição por aproximadamente 30 minutos, a fim de relaxar a tensão xileto. Depois disso, meça novamente o potencial hídrico para confirmar o relaxamento da tensão xilema. Primeiro, use uma tesoura ou uma faca de utilidade para cortar e abrir um lado de uma coleira apertada.
Coloque a coleira firmemente ao redor da haste com fita adesiva enquanto segura a abertura horizontalmente. Coloque luvas isolantes, e segure com segurança o vaso de nitrogênio líquido. Execute nitrogênio líquido no colarinho até que esteja cheio e mantenha-o preenchido, adicionando nitrogênio líquido adicional para congelar completamente a água no xilema.
Após tempo suficiente de congelamento, retire a coleira da porção congelada da haste da amostra, a fim de remover o nitrogênio líquido. Use imediatamente uma serra de mão fina para colher a amostra. Em seguida, cubra a amostra congelada com um pedaço de papel alumínio ou coloque-a de volta em um tubo de amostra.
Coloque rapidamente a amostra colhida em um recipiente cheio de nitrogênio líquido. Armazene as amostras a menos 80 graus Celsius até que estejam prontas para realizar a observação. Para começar, defina a temperatura da câmara de espécimes do criostat para menos 30 graus Celsius, que geralmente é fria o suficiente para manter a seiva de xilema da maioria das plantas em um estado congelado.
Use uma faca afiada ou uma serra de dentes finos para aparar a amostra em um pequeno pedaço que pode ser ajustado para o suporte de espécime de um crio-SEM. Monte a peça aparada em um mandril, um suporte para um criostat, com meio de incorporação de congelamento de tecido para crio-seção. Conecte o mandril a um suporte de espécime de um microtome do criostat.
Corte a superfície raspando repetidamente seções de cinco a sete micrômetros de espessura. Cortar mais de 1.000 a 2.000 micrômetros em profundidade total à superfície inicial é útil para a mente danificada da amostra causada pelo pré-corte. Depois de aproximadamente aparar uma superfície da amostra, ajuste uma porção não utilizada da lâmina de microtome acima da superfície do espécime.
Amplie ligeiramente a distância entre a superfície do espécime e a lâmina. E corte a superfície apenas uma ou duas vezes. Em seguida, deslize a lâmina novamente e posicione uma porção não utilizada da lâmina sobre a superfície do espécime.
Repita este processamento de corte três a quatro vezes para obter uma superfície clara sem marcas de faca. Após o corte final, coloque a posição da lâmina longe da amostra para evitar que a poeira grude na amostra. E desprende o mandril do microtome.
Em seguida, conecte o espécime a um suporte de espécime crio-SEM com meio de incorporação de congelamento de tecido na câmara criostat. Primeiro, use nitrogênio líquido para manter uma temperatura abaixo de menos 120 Celsius na câmara de espécimes crio-SEM de acordo com o manual do usuário do equipamento. Em seguida, coloque o porta-espécimes com o espécime preparado em um recipiente isolante cheio de nitrogênio líquido na câmara criostat.
Use uma haste de troca de espécimes para segurar o suporte da amostra sob o nitrogênio líquido. Transfira rapidamente o titular do espécime para a câmara de pré-evacuação da câmara de espécimes crio-SEM assim que iniciar a evacuação da câmara de pré-evacuação. Para começar, ligue a tensão de aceleração da arma elétrica.
Em seguida, eleve a temperatura do estágio da amostra para menos 100 graus Celsius. Aguarde vários minutos para que a poeira de geada seja removida e para que o nível de superfície do gelo nas células xilema diminua ligeiramente em comparação com as paredes celulares. Em seguida, abaixe a temperatura do estágio de espeliumen para menos 120 graus Celsius.
Neste estudo, os métodos de observação crio-SEM são utilizados para visualizar claramente a distribuição de água em escala celular. Em baixa ampliação, a área negra nas imagens indica as cavidades das quais a água desaparece total ou parcialmente, enquanto a área cinza indica paredes celulares xilema, citoplasma e água. Em alta ampliação, torna-se evidente que a água não está totalmente perdida da luminária de três traqueidos, indicando a ocorrência de bolhas macro na seiva de xilema in situ.
Com relação às espécies de licenças largas, a ocorrência de cavitação é facilmente detectada dentro dos vasos, enquanto a existência da água é difícil de distinguir dentro das fibras, especialmente na baixa ampliação. As células citoplasma e parenchyma podem ser distinguidas da água dentro de traqueidas ou vasos através de texturas de plano de gelo. A análise do efeito da temperatura no processo de congelamento revela que a poeira geada é gradualmente sublimada, e as membranas endotracides se tornam mais claras através da progressão da sublimação com o aumento da temperatura.
As grandes partículas de pó de geada restantes podem ser eliminadas por uma gravação mais congelada. Mas isso pode ser problemático, pois diminui desnecessariamente o nível de superfície do gelo em conduítes xilema. A alta qualidade da observação é em grande parte alcançada através da preparação precisa dos espécimes.
A alisamento da superfície com a lâmina afiada do microtoma é especialmente importante. A alisamento insuficiente por uma lâmina usada pode às vezes criar uma superfície áspera que se assemelha a marcas de faca, ou pode criar inúmeras ocorrências de poeira a partir dos cortes. O congelamento da amostra sem o relaxamento da pressão negativa da coluna de água causará indução artefatofato de cavitação em conduítes xilema.
Cristais de gelo agrupados são observados em vasos de espécimes onde a amostra não foi relaxada. Contrastantemente, nenhum cristais de gelo agrupados são observados nos espécimes de amostras relaxadas com um potencial hídrico semelhante. A aplicação da fixação de congelamento a plantas vivas que sofrem seca pode induzir artefatos baseados em resultados, como cristais de gelo agrupados.
Esses artefatos levam a interpretações erradas do estado da água no conduíte xilema. Por isso, é importante primeiro confirmar o potencial hídrico das amostras antes da fixação do congelamento. Embora este procedimento prevea uma imagem de que status no conduíte xilema, uma árvore viva deve ser destruída para a observação.
A combinação de outros métodos de observação não invasivos, como ressonância magnética ou microctura com observação de imagem de nível subsidiário, aprofundará nossa compreensão da natureza entre transporte de água e uso. A observação do estado hídrico introduzido por este artigo também fornecerá um método para o esclarecimento da relação da água que se mistura nas células e outras respostas anatômicas ao estresse abiótico ou biótico. Crio-SEM equipado com espectroscopia de raios-X dispersivos de energia ou top sim têm sido usados para estudar a distribuição de elementos sobre a superfície de um espécime contendo água.
A combinação da análise elementar e este procedimento nesse quadro semelhante pode nos dar profundo conhecimento do comportamento da célula xilema relacionada ao estado da água. Ao usar nitrogênio líquido para fixação congelante de amostras em uma sala, não se esqueça de ventilar a sala para evitar a deficiência de oxigênio.
