El objetivo general de este protocolo es proporcionarnos una resolución de electromicroscopía de la distribución de agua en varios tipos de células xilem in situ. Este método se ha utilizado para observar el agua en xillem con el fin de aclarar la distribución del agua y los regímenes cambiantes del agua, la variación estacional de la distribución del agua, el efecto de los ciclos de congelación / descongelación, la distribución de agua en la madera húmeda, y la cavitación inducida por ciertas tensiones bióticas. La fijación por congelación de un tronco vivo bajo altas tensiones hidráulicas a veces causa cavitaciones artificiales, que son observadas por crio-SEM como cristales de hielo rotos en el lumen de conducto.
Este procedimiento actualizado se centra en la obtención de micrografías aerotódmicas de alta calidad de xilem sin el artefacto en el procedimiento de muestreo. La demostración viable es crítica porque hay una serie de detalles importantes que no se pueden explicar fácilmente. Al mismo tiempo, obtener formación no es fácil porque sólo unos pocos laboratorios de todo el mundo practican este método.
Para comenzar este procedimiento, encierre una rama y las hojas para el muestreo con una bolsa de plástico negro para equilibrar el potencial de agua entre el xillem y las hojas más de dos horas antes del muestreo. Usando una cámara de presión, determine el potencial de agua de al menos dos hojas de la muestra. Cuando el potencial de agua es mayor que aproximadamente menos 0,5 megapascales, se puede cosechar una muestra después de la congelación.
Cuando el potencial de agua sea inferior a menos de 0,5 megapascales, proceda con el tratamiento para la relajación. Fije un collar estanco alrededor del tallo, que se llenará con agua. Usando tijeras de poda o una sierra, corte el tallo debajo de la superficie del agua y mantenga el extremo de corte de la muestra bajo el agua.
Transfiera la muestra a otro recipiente de agua lo más rápido posible para minimizar la exposición del extremo cortado al aire. Para las especies de hojas anchas, asegúrese de que la longitud desde el lugar donde se obtendrá la muestra criogénica para SEM hasta el borde de corte del tallo cosechado sea más larga que la longitud máxima del recipiente de la muestra con el fin de evitar artefactos inducidos por tensión dentro del crioample. A continuación, cubra la muestra con una bolsa de plástico negra para reducir la transpiración.
Mantener el extremo cortado de la muestra en el agua y mantener esta condición durante aproximadamente 30 minutos con el fin de relajar la tensión del xiónigo. Después de esto, medir el potencial de agua de nuevo para confirmar la relajación de la tensión del xiónigo. En primer lugar, utilice tijeras o un cuchillo de utilidad para cortar y abrir un lado de un collar hermético.
Fije el collar firmemente alrededor del tallo con cinta adhesiva mientras sostiene la abertura horizontalmente. Póngase guantes aislantes y sostenga con seguridad el recipiente de nitrógeno líquido. Ejecuta nitrógeno líquido en el collar hasta que esté lleno y mantenlo lleno añadiendo constantemente nitrógeno líquido adicional para congelar completamente el agua en el xílem.
Después de un tiempo de congelación suficiente, desprenda el collar de la porción congelada del tallo de la muestra para eliminar el nitrógeno líquido. Utilice inmediatamente una sierra de mano fina para cosechar la muestra. A continuación, cubra la muestra congelada con un trozo de papel de aluminio o vuelva a colocarla en un tubo de muestra.
Coloque rápidamente la muestra cosechada en un recipiente lleno de nitrógeno líquido. Almacene las muestras a menos 80 grados centígrados hasta que estén listas para realizar la observación. Para empezar, establezca la temperatura de la cámara de muestras del criostato en menos 30 grados Celsius, que generalmente es lo suficientemente fría como para mantener la savia de xylem de la mayoría de las plantas en un estado congelado.
Utilice un cuchillo afilado o una sierra de dientes finos para recortar la muestra en una pequeña pieza que se puede ajustar para el soporte de la muestra de un crio-SEM. Monte la pieza recortada en un mandril, un soporte para un criostato, con medio de incrustación de congelación de tejido para crioseció. Fije el mandril a un soporte de muestra de un microtoma del criostato.
Recorte la superficie afeitando repetidamente de cinco a siete secciones de espesor. Cortar más de 1.000 a 2.000 micrómetros en profundidad total a la superficie inicial es útil para elmininizar la parte dañada de la muestra causada por el pre-corte. Después de recortar aproximadamente una superficie de la muestra, ajuste una porción no utilizada de la hoja de microtoma por encima de la superficie de la muestra.
Ensancha ligeramente la distancia entre la superficie de la muestra y la hoja. Y cortar la superficie sólo una o dos veces. A continuación, deslice la hoja de nuevo y coloque una parte no utilizada de la hoja sobre la superficie de la muestra.
Repita este procesamiento de corte de tres a cuatro veces para obtener una superficie clara sin marcas de cuchillo. Después del corte final, coloque la posición de la hoja lejos de la muestra para evitar que el polvo se pegue a la muestra. Y separa el mandril del microtoma.
A continuación, adjunte la muestra a un soporte de muestra crio-SEM con medio de incrustación de congelación de tejido en la cámara de criostato. En primer lugar, utilice nitrógeno líquido para mantener una temperatura inferior a menos 120 grados celsius en la cámara de muestras crio-SEM de acuerdo con el manual del usuario del equipo. A continuación, coloque el portaespecís con la muestra preparada en un recipiente aislante lleno de nitrógeno líquido en la cámara del criostato.
Utilice una barra de intercambio de muestras para sujetar el soporte de la muestra debajo del nitrógeno líquido. Transfiera rápidamente el soporte de la muestra a la cámara de pre-evacuación de la cámara de muestra crio-SEM tan pronto como comience la evacuación de la cámara de pre-evacuación. Para empezar, encienda el voltaje de aceleración de la pistola eléctrica.
A continuación, suba la temperatura de la etapa de la muestra a menos 100 grados centígrados. Espere varios minutos para que se elimine el polvo de escarcha y para que el nivel superficial del hielo en las células del xilán disminuya ligeramente en comparación con las paredes celulares. A continuación, baje la temperatura de la etapa speiumen a menos 120 grados centígrados.
En este estudio, los métodos de observación crio-SEM se utilizan para visualizar claramente la distribución del agua a escala celular. Con bajo aumento, el área negra en las imágenes indica las cavidades de las que el agua desaparece total o parcialmente, mientras que el área gris indica las paredes celulares del xilem, el citoplasma y el agua. Con un alto aumento, se hace evidente que el agua no se pierde por completo de la lumina de tres traejes, lo que indica la ocurrencia de macro burbujas en la savia del xiónico in situ.
Con respecto a las especies de hojas anchas, la aparición de cavitación se detecta fácilmente dentro de los vasos, mientras que la existencia de agua es difícil de distinguir dentro de las fibras, especialmente con bajo aumento. Las células del citoplasma y del parénquima se pueden distinguir del agua dentro de los trazadores o vasos a través de texturas de planos de hielo. El análisis del efecto de la temperatura en el proceso de congelación y grabado revela que el polvo de escarcha se sublima gradualmente, y las membranas de foso endotracehid se vuelven más claras a través de la progresión de la sublimación con el aumento de la temperatura.
Las grandes partículas de polvo de escarcha restantes se pueden eliminar mediante un mayor grabado en congelación. Pero esto puede ser problemático, ya que disminuye innecesariamente el nivel superficial de hielo en los conductos de xylem. La alta calidad de la observación se logra en gran medida a través de una preparación precisa de la muestra.
El alisamiento de la superficie con la hoja afilada del microtoma es especialmente importante. El suavizado insuficiente por una hoja usada a veces puede crear una superficie rugosa que se asemeja a las marcas de cuchillo, o puede crear numerosas apariciones de polvo de los cortes. La congelación de la muestra sin la relajación de la presión negativa de la columna de agua causará la inducción artefactol de la cavitación en los conductos de xílem.
Los cristales de hielo agrupados se observan en recipientes de especímenes donde la muestra no se relajó. En contraste, no se observan cristales de hielo agrupados en los especímenes de muestra relajados con un potencial de agua similar. La aplicación de la fijación por congelación a las plantas vivas que transpiran y que sufren sequías puede inducir artefactos basados en resultados, como cristales de hielo agrupados.
Esos artefactos conducen a interpretaciones erróneas del estado del agua en el conducto de xylem. Por lo tanto, es importante confirmar primero el potencial de agua de las muestras antes de la fijación por congelación. Aunque este procedimiento proporciona una imagen de qué estado en el conducto de xylem, un árbol vivo debe ser destruido para la observación.
La combinación de otros métodos de observación no invasivos como la RMN o la micro-CT con la observación de imágenes a nivel subsidiario profundizará nuestra comprensión de la naturaleza entre el transporte de agua y el uso. La observación del estado del agua introducida por este documento también proporcionará un método para la clarificación de la relación del agua que se mezcla en las células y otras respuestas anatómicas al estrés abiótico o biótico. Cryo-SEM equipado con espectroscopia de rayos X dispersiva de energía o sim superior se han utilizado para estudiar la distribución de elementos sobre la superficie de una muestra que contiene agua.
La combinación del análisis elemental y este procedimiento en ese marco similar puede darnos un profundo conocimiento del comportamiento celular del xiónigo relacionado con el estado del agua. Cuando utilice nitrógeno líquido para la fijación por congelación de muestras en una habitación, no olvide ventilar la habitación para evitar la deficiencia de oxígeno.
