L’objectif global de ce protocole est de nous fournir une résolution électromicroscopy de la distribution de l’eau dans divers types de cellules xylèmes in situ. Cette méthode a été utilisée pour observer l’eau dans le xylème afin de clarifier la distribution de l’eau et l’évolution des régimes arrosés, la variation saisonnière de la distribution de l’eau, l’effet des cycles de gel/dégel, la distribution de l’eau dans le bois humide et la cavitation induite par certaines contraintes biotiques. Le gel-fixation d’un tronc vivant sous de fortes tensions hydrauliques provoque parfois des cavitations artificielles, qui sont observées par cryo-SEM comme cristaux de glace rompus dans le lumen du conduit.
Cette procédure mise à jour se concentre sur l’obtention de micrographes aérotomes de haute qualité de xylème sans l’artefact dans la procédure d’échantillonnage. Une démonstration viable est essentielle parce qu’il y a un certain nombre de détails importants qui ne peuvent pas être facilement expliqués. Dans le même temps, l’obtention d’une formation n’est pas facile parce que seuls quelques laboratoires à travers le monde pratiquent cette méthode.
Pour commencer cette procédure, enfermer une branche et les feuilles pour l’échantillonnage avec un sac en plastique noir pour équilibrer le potentiel d’eau entre xylème et laisse plus de deux heures avant l’échantillonnage. À l’aide d’une chambre de pression, déterminer le potentiel arrosé d’au moins deux feuilles de l’échantillon. Lorsque le potentiel d’eau est supérieur à environ moins 0,5 mégapascal, un échantillon peut être prélevé après congélation.
Lorsque le potentiel d’eau est inférieur à moins 0,5 mégapascals, procéder au traitement pour la relaxation. Fixer un collier étanche autour de la tige, qui sera rempli d’eau. À l’aide de cisailles d’élagage ou d’une scie, couper la tige sous la surface de l’eau et garder l’extrémité coupée de l’échantillon sous l’eau.
Transférez l’échantillon dans un autre contenant d’eau le plus rapidement possible afin de minimiser l’exposition de l’extrémité coupée à l’air. Pour les espèces à feuilles larges, assurez-vous que la longueur de l’endroit où l’échantillon cryo de sem sera obtenu jusqu’au bord coupé de la tige récoltée est plus longue que la longueur maximale du navire de l’échantillon afin d’éviter les artefacts induits par la tension dans le crysoample. Ensuite, couvrez l’échantillon d’un sac en plastique noir pour réduire la transpiration.
Gardez l’extrémité coupée de l’échantillon dans l’eau et maintenez cette condition pendant environ 30 minutes afin de détendre la tension xylème. Après cela, mesurer le potentiel d’eau à nouveau pour confirmer la relaxation de la tension xylème. Tout d’abord, utilisez des ciseaux ou un couteau utilitaire pour couper et ouvrir un côté d’un collier étanche à l’eau.
Attachez le collier étroitement autour de la tige avec du ruban adhésif tout en tenant l’ouverture horizontalement. Mettez des gants isolants et tenez en toute sécurité le récipient d’azote liquide. Faire entrer l’azote liquide dans le col jusqu’à ce qu’il soit plein et le garder rempli en ajoutant régulièrement de l’azote liquide supplémentaire pour congeler complètement l’eau dans le xylème.
Après un temps de congélation suffisant, détachez le collier de la partie gelée de la tige de l’échantillon afin d’éliminer l’azote liquide. Utilisez immédiatement une fine scie à main pour récolter l’échantillon. Couvrez ensuite l’échantillon congelé d’un morceau de papier d’aluminium ou remetez-le dans un tube d’échantillon.
Placez rapidement l’échantillon récolté dans un récipient rempli d’azote liquide. Conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à effectuer l’observation. Pour commencer, réglez la température de la chambre de spécimen du cryostat à moins 30 degrés Celsius, qui est habituellement assez froid pour maintenir la sève xylème de la plupart des plantes dans un état gelé.
Utilisez un couteau pointu ou une scie à dents fines pour couper l’échantillon en un petit morceau qui peut être ajusté pour le porte-spécimen d’un cryo-SEM. Montez la pièce taillée à un mandrin, un support pour un cryostat, avec un milieu d’intégration glaçant les tissus pour le cryo-sectionnement. Fixez le mandrin à un porte-spécimen d’une microtome du cryostat.
Coupez la surface en rasant à plusieurs reprises les sections de cinq à sept micromètres d’épaisseur. Couper plus de 1000 à 2000 micromètres en profondeur totale à la surface initiale est utile pour elmininer la partie endommagée de l’échantillon causée par la précoupage. Après avoir grossièrement écrémé une surface de l’échantillon, ajustez une partie inutilisée de la lame de microtome au-dessus de la surface de l’échantillon.
Élargir légèrement la distance entre la surface du spécimen et la lame. Et ne coupez la surface qu’une ou deux fois. Ensuite, faites glisser la lame à nouveau et placez une partie inutilisée de la lame sur la surface de l’échantillon.
Répétez ce traitement de coupe trois à quatre fois pour obtenir une surface claire sans marques de couteau. Après la coupe finale, placez la position de la lame loin de l’échantillon pour empêcher la poussière de coller sur l’échantillon. Et détachez le mandrin de la microtome.
Ensuite, fixez le spécimen à un porte-spécimen cryo-SEM avec un milieu d’intégration de congélation des tissus dans la chambre cryostatique. Tout d’abord, utilisez de l’azote liquide pour maintenir une température inférieure à moins 120 Degrés Celsius dans la chambre de spécimen cryo-SEM selon le manuel de l’utilisateur de l’équipement. Ensuite, placez le porte-spécimen avec le spécimen préparé dans un récipient isolant rempli d’azote liquide dans la chambre cryostatique.
Utilisez un spécimen échangeant une tige pour tenir le porte-spécimen sous l’azote liquide. Transférer rapidement le porte-spécimen à la chambre de pré-évacuation de la chambre de spécimen cryo-SEM dès le début de l’évacuation de la chambre de pré-évacuation. Pour commencer, allumez la tension d’accélération du canon électrique.
Ensuite, augmenter la température du stade de l’échantillon à moins 100 degrés Celsius. Attendez plusieurs minutes que la poussière de givre soit enlevée et que le niveau de surface de la glace dans les cellules xylème diminue légèrement par rapport aux parois cellulaires. Ensuite, abaissez la température du stade speiumen à moins 120 degrés Celsius.
Dans cette étude, des méthodes d’observation cryo-SEM sont utilisées pour visualiser clairement la distribution de l’eau à l’échelle cellulaire. À faible grossissement, la zone noire des images indique les cavités d’où l’eau disparaît entièrement ou partiellement, tandis que la zone grise indique les parois cellulaires xylèmes, le cytoplasme et l’eau. Au grossissement élevé, il devient évident que l’eau n’est pas entièrement perdue du lumina de trois trachéides, ce qui indique l’apparition de bulles macro dans la sève xylème in situ.
En ce qui concerne les espèces à larges lamentations, l’occurrence de cavitation est facilement détectée dans les navires, tandis que l’existence de l’eau est difficile à distinguer dans les fibres, en particulier à faible grossissement. Les cellules de cytoplasme et de parenchyme peuvent être distinguées de l’eau dans les trachées ou les vaisseaux par des textures de plan de glace. L’analyse de l’effet de la température sur le processus de gel-gravure révèle que la poussière de gel est graduellement sublimée, et les membranes de fosse endotracehid deviennent plus claires par la progression de la sublimation avec la température croissante.
Les grosses particules de poussière de givre restantes peuvent être éliminées par d’autres eaux-froids. Mais cela peut être problématique car il diminue inutilement le niveau de surface de la glace dans les conduits xylèmes. La haute qualité de l’observation est largement obtenue grâce à une préparation précise des spécimens.
Le lissage de la surface avec la lame tranchante du microtome est particulièrement important. Un lissage insuffisant par une lame usée peut parfois créer une surface rugueuse qui ressemble à des marques de couteau, ou peut créer de nombreuses occurrences de poussière à partir des coupures. Le gel d’échantillon sans la relaxation de la pression négative de colonne d’eau causera l’induction artifactual de la cavitation dans les conduits de xylème.
Des cristaux de glace groupés sont observés dans des récipients de spécimens où l’échantillon n’a pas été relâché. En revanche, aucun cristaux de glace groupé n’est observé dans les échantillons détendus ayant un potentiel d’eau similaire. L’application de fixation du gel aux plantes vivantes transpirantes qui souffrent de sécheresse peut induire des artefacts fondés sur des résultats tels que des cristaux de glace groupés.
Ces artefacts conduisent à des interprétations erronées de l’état de l’eau dans le conduit xylème. Il est donc important de confirmer d’abord le potentiel arrosé des échantillons avant la fixation du gel. Bien que cette procédure donne une image de l’état du conduit xylème, un arbre vivant doit être détruit pour l’observation.
La combinaison d’autres méthodes d’observation non invasives telles que l’IRM ou le micro-CT avec l’observation de l’image au niveau subsidiaire approfondira notre compréhension de la nature entre le transport maritime et l’utilisation. L’observation de l’état de l’eau introduite par cet article fournira également une méthode pour clarifier la relation de l’eau qui est mélangée dans les cellules et d’autres réponses anatomiques au stress abiotique ou biotique. Cryo-SEM équipé d’une spectroscopie à rayons X dispersive d’énergie ou d’une carte SIM supérieure ont été utilisés pour étudier la distribution d’éléments à la surface d’un spécimen contenant de l’eau.
La combinaison de l’analyse élémentaire et de cette procédure dans ce cadre similaire peut nous donner une connaissance approfondie du comportement des cellules xylèmes liés à l’état de l’eau. Lorsque vous utilisez de l’azote liquide pour congeler la fixation des échantillons dans une pièce, n’oubliez pas de ventiler la pièce pour éviter une carence en oxygène.
