Bu protokolün genel amacı, çeşitli ksilem hücrelerinde su dağılımının elektromikroskobu çözünürlüğü sağlamaktır. Bu yöntem, su dağılımını ve değişen su rejimlerini, su dağılımının mevsimsel değişimini, donma/çözülme döngülerinin etkisini, ıslak odunlarda suyun dağılımını ve bazı biyotik streslerin neden olduğu kavitasyonu netleştirmek için ksilemdeki suyu gözlemlemek için kullanılmıştır. Yüksek hidrolik gerilimler altında yaşayan bir gövdenin donma fiksasyonu bazen kondüblülüde yırtık buz kristalleri olarak kriyo-SEM tarafından gözlenen yapay kavitasyonlara neden olur.
Bu güncelleştirilmiş prosedür örnekleme prosedüründe artifakı olmadan ksilemin yüksek kaliteli aerotom mikrograflarını elde etmeye odaklanır. Kolayca açıklanamayan bir dizi önemli ayrıntı olduğundan, uygun gösteri çok önemlidir. Aynı zamanda, eğitim almak kolay değildir, çünkü dünya çapında sadece birkaç laboratuvar bu yöntemi uygular.
Bu yordamı başlatmak için, bir dal içine ve ksilem arasındaki su potansiyelini dengelemek için siyah bir plastik torba ile örnekleme için yaprakları ve örnekleme iki saatten fazla bırakır. Bir basınç odası kullanarak, örnekten en az iki yaprağın su potansiyelini belirleyin. Su potansiyeli yaklaşık eksi 0,5 megapascal'dan yüksek olduğunda, bir numune dondurulduktan sonra hasat edilebilir.
Su potansiyeli eksi 0,5 megapascal'dan daha düşük olduğunda, rahatlama tedavisine devam edin. Su ile doldurulacak kök etrafında bir su geçirmez yaka düzeltmek. Budama makası veya testere kullanarak, su yüzeyinin altındaki sapı kesin ve numunenin kesme ucunu su altında tutun.
Kesme ucunu nisasına en aza indirmek için numuneyi mümkün olan en kısa sürede başka bir su kabına aktarın. Geniş türler için, SEM için kriyo numunesinin elde edeceği noktadan hasat sapının kesme kenarına kadar olan uzunluğun, crysoample içinde gerilime bağlı objeleri önlemek için numunenin maksimum damar uzunluğundan daha uzun olduğundan emin olun. Daha sonra, transpirasyonu azaltmak için numuneyi siyah plastik bir torbaile kaplayın.
Numunenin kesme ucunu suda tutun ve ksilem gerilimini rahatlatmak için bu durumu yaklaşık 30 dakika koruyun. Bundan sonra, ksilem geriliminin gevşemesini onaylamak için su potansiyelini tekrar ölçün. İlk olarak, su geçirmez bir yakanın bir tarafını kesip açmak için makas veya yardımcı bıçak kullanın.
Diyafram açıklığını yatay olarak tutarken, tasmayı yapışkan bantla sapın etrafına sıkıca takın. Yalıtım eldivenleri takın ve sıvı nitrojen damarını güvenli bir şekilde tutun. Tam olana kadar yaka içine sıvı nitrojen çalıştırın ve tamamen ksilem su dondurmak için sürekli ek sıvı nitrojen ekleyerek dolu tutmak.
Yeterli donma süresinden sonra, sıvı nitrojeni çıkarmak için yakayı numunenin donmuş kısmından ayırın. Hemen örnek hasat için ince bir el testere kullanın. Daha sonra dondurulmuş numuneyi bir parça alüminyum folyo ile kaplayın veya numune tüpüne geri koyun.
Hasat edilen numuneyi sıvı nitrojen dolu bir kap içine hızla yerleştirin. Gözlemi yapmaya hazır olana kadar örnekleri eksi 80 derecede saklayın. Başlamak için, kriyostat numune odasının sıcaklığını eksi 30 santigrat dereceye ayarlayın, ki bu genellikle çoğu bitkinin ksilem özsuyunu donmuş durumda tutacak kadar soğuktur.
Numuneyi kriyo-SEM numune tutucusu için ayarlanabilen küçük bir parçaya börmek için keskin bir bıçak veya ince dişli testere kullanın. Kesilmiş parçayı bir chuck'a, bir kriyostat tutucuya, doku dondurucu katıştırma ortamına monte edin. Chuck'ı kriyostat bir mikrotomun numune tutucuya takın.
Beş ila yedi mikrometre kalınlığındaki bölümleri tekrar tekrar tıraş ederek yüzeyi kırpın. İlk yüzeye toplam derinliği 1,000 ila 2,000 mikrometreden fazla kesmek, numunenin ön kesimden kaynaklanan hasarlı kısmının elmininatating için yararlıdır. Numunenin yüzeyini kabaca kestikten sonra, mikrotom bıçağının kullanılmayan bir kısmını numunenin yüzeyinin üzerinde ayarlayın.
Numunenin yüzeyi ile bıçak arasındaki mesafeyi biraz genişletin. Ve yüzeyi sadece bir ya da iki kez kesin. Daha sonra bıçağı tekrar kaydırın ve bıçağın kullanılmayan bir kısmını numune yüzeyine yerleştirin.
Bıçak izi olmadan net bir yüzey elde etmek için bu kesme işlemini 3-4 kez tekrarlayın. Son kesimden sonra, tozun numuneye yapışmasını önlemek için bıçağın konumunu numuneden çok uzak bir şekilde ayarlayın. Ve chuck'ı mikrotomdan ayır.
Daha sonra, örneği kriyostat haznesinde doku dondurucu katıştırma ortamına sahip bir kriyo-SEM numune tutucuya takın. İlk olarak, ekipman kullanım kılavuzuna göre kriyo-SEM numune odasında eksi 120 santigrat derecenin altında bir sıcaklık korumak için sıvı nitrojen kullanın. Daha sonra, hazırlanan numune ile numune tutucuyu kriyostat haznesinde sıvı nitrojenle dolu bir yalıtım kabına yerleştirin.
Numune tutucuyu sıvı nitrojenin altında tutmak için numune alışverişi çubuğu kullanın. Numune tutucuyu, tahliye öncesi odanın tahliyesine başlar başlamaz kriyo-SEM numune odasının ön tahliye odasına hızla aktarın. Başlamak için, elektrik tabancasının hızlanma gerilimini açın.
Daha sonra, numune aşamasının sıcaklığını eksi 100 dereceye yükseltin. Don tozunun temizlenmesi ve ksilem hücrelerindeki buzun yüzey seviyesinin hücre duvarlarına göre biraz düşmesi için birkaç dakika bekleyin. Daha sonra, speiumen sahnesıcaklığını eksi 120 santigrat dereceye düşürün.
Bu çalışmada, kriyo-SEM gözlem yöntemleri hücresel ölçekte su dağılımını açıkça görselleştirmek için kullanılmaktadır. Düşük büyütmede, görüntülerdeki siyah alan suyun tamamen veya kısmen kaybolduğu boşlukları gösterirken, gri alan ksilem hücre duvarlarını, sitoplazmayı ve suyu gösterir. Yüksek büyütme de, su tamamen üç tracheids lumina kayıp olmadığı belirgin hale gelir, yerinde ksilem sap makro kabarcıklar oluşumunu gösteren.
Geniş-terk türler ile ilgili olarak, kavitasyon oluşumu damarlar içinde kolayca tespit edilir, su varlığı lifler içinde ayırt etmek zor iken, özellikle düşük büyütme. Sitoplazma ve parankim hücreleri buz düzlemi dokular aracılığıyla tracheids veya kaplar içinde sudan ayırt edilebilir. Sıcaklığın donma-gravür işlemi üzerindeki etkisinin analizi, don tozunun kademeli olarak süblimhale geldiğini ve endotracehid pit membranlarının artan sıcaklıkla süblimleşmenin ilerlemesi ile daha net hale geldiğini ortaya koymaktadır.
Kalan büyük don tozu parçacıkları daha fazla donma-gravür ile ortadan kaldırılabilir. Ama bu, ksilem kanallarındaki buzun yüzey seviyesini gereksiz yere düşürtteği için sorunlu olabilir. Yüksek kaliteli gözlem, büyük ölçüde doğru numune hazırlama ile elde edilir.
Mikrotomun keskin bıçağı ile yüzeyin düzitilmesi özellikle önemlidir. Kullanılmış bir bıçak tarafından yetersiz yumuşatma bazen bıçak işaretleri benzer pürüzlü bir yüzey oluşturabilir, ya da kesikler toz çok sayıda oluşumlar oluşturabilirsiniz. Negatif su sütunu basıncıgevşemeden numune dondurma ksilem kanallarında kavitasyon artifif indüksiyon neden olacaktır.
Kümelenmiş buz kristalleri, numunenin rahat olmadığı numune kaplarında görülür. Buna karşılık, benzer su potansiyeline sahip rahat numune örneklerinde kümelenmiş buz kristalleri gözlenmez. Kuraklık çeken transpiring canlı bitkileriçin donma fiksasyon uygulaması kümelenmiş buz kristalleri gibi sonuç tabanlı eserler neden olabilir.
Bu eserler ksilem kanalındaki su durumunun yanlış yorumlanmasına yol açar. Bu nedenle, öncelikle donma fiksasyonundan önce numunelerin su potansiyelini doğrulamak önemlidir. Bu yordam, ksilem kanalının durumunun bir görüntüsünü sağlasa da, gözlem için yaşayan bir ağacın yok edilmesi gerekir.
MRG veya mikro-BT gibi diğer non-invaziv gözlem yöntemlerinin yan düzey görüntü gözlemiyle birleştirilmesi, su taşıma ve kullanım arasındaki doğa anlayışımızı derinleştirecektir. Bu kağıt tarafından tanıtılan su durumunun gözlemi de hücrelerde karışık su ilişkisi ve abiyotik veya biyotik strese diğer anatomik tepkiler için bir yöntem sağlayacaktır. Cryo-SEM enerji dağılımlı x-ışını spektroskopisi veya üst sim ile donatılmış su içeren bir numunenin yüzeyinde element dağılımı çalışma için kullanılmıştır.
Elementanalizi ve bu prosedürü benzer çerçevede birleştirmek bize su durumu ile ilgili ksilem hücre davranışı hakkında derin bilgi verebilir. Bir odada numunelerin dondurulması için sıvı nitrojen kullanırken, oksijen eksikliğini önlemek için odayı havalandırmayı unutmayın.
