הפרוטוקול שליז פיתחה מאפשר לנו לקבוע את שיעור ההפריה של הלבנים. יישום טכניקה זו ישפר את הבנתנו את ההתנהגות והאקולוגיה של whiteflies. Whiteflies הם haplodiploid, ולכן שיעור ההפריה שווה ליחס המין ב oviposition.
פרוטוקול זה הוא הראשון המתואר עבור whiteflies, לדעתנו, והוא יכול להסתיים בתוך שלוש שעות. כדי להתחיל, לעשות חור כיסוי בצלחת פטרי לכסות כדי להכניס ולהסיר את הגחליליות הלבנות למבוגרים. הגדר תא לחות ואופנת בדיקה על ידי החדרת סיכה דקה בזווית עבודה נוחה לתוך קצה פיפטה מומס לעשות בדיקה דקה.
באופן אופציונלי, להאריך טיפים פיפטה זכוכית עם חום לטיפול קל יותר של ביצים לבן. לאחר מכן, לאפשר לבנים נקבה oviposit על עלה נקי, לחתוך כדי להתאים אגר בצלחת פטרי. במהלך oviposition לבן, לנקות מגלשת מיקרוסקופ עם מים וסבון.
יבש אותו היטב למתוח חתיכת סרט פרפין על קצה אחד כדי לאפשר לנוזלים ליצור טיפות וביצים להיראות בקלות רבה יותר. כדי dechorionate ביצים, להשתמש פיפטה פסטר זכוכית להוסיף טיפות של 83% נתרן hypochlorite אקונומיקה פתרון לסרט פרפין ממש לפני הסרת מבוגרים ואיסוף ביצים. אקונומיקה וחומצה אצטית קרחונית הן קורוזיביות.
הם צריכים להיות מטופלים עם כפפות במכסה המנוע או באזור מאוורר היטב. DAPI הוא גם מרגיז ויש לטפל בו עם כפפות. לאחר מכן, להסיר את whiteflies למבוגרים מן העלה ולה מניחים את העלה תחת מיקרוסקופ.
בזהירות להרים כל ביצה מבסיסו עד pedicel מוסר מן העלה. תרגלו על ביצים רבות לפני ביצוע פרוטוקול זה. הרם את הביצים לאט מהבסיס והרם אותו במלואו מהעלה ברגע שאתה יכול לראות כי פדיקל הביצה מוסר מן העלה.
מעבירים שתיים עד שלוש ביצים לכל טיפת אקונומיקה ומשאירים אותן למשך 10 דקות. כדי לתקן את הביצים, השתמש פיפטה זכוכית כדי להשליך את האקונומיקה. לאחר מכן, מוסיפים טיפות של חומצה אצטית קרחונית ומחכים שלוש דקות.
לאחר מכן, להסיר את חומצה אצטית קרחוני ולהוסיף טיפות של הפתרון של קלארק. לאחר מכן, המתן 10 דקות עד שרוב הפתרון התאדה. מוסיפים טיפות של 70% אתנול ומחכים שוב במשך 10 דקות.
כדי להכתים את הביצים, ראשית להסיר כל אתנול שיורית. לאחר מכן, מוסיפים טיפות של 1xPBS לביצים כדי לקבל את ה- pH קרוב לשבע. שים את מגלשת המיקרוסקופ בתא לחות כדי למנוע ייעוד.
לאחר 30 דקות, להסיר את 1xPBS ולהוסיף טיפות של 1 מיקרוגרם לכל DAPI מיליליטר. שים את החלקת המיקרוסקופ בתא לחות כהה והמתן לפחות 15 דקות. כדי לשטוף ביצים, הסר תחילה את פתרון DAPI.
לאחר מכן להוסיף טיפות של 1xTBST לביצים. לאחר חמש דקות, הסר את 1xTBST. חזור על שטיפה זו פעמיים נוספות עבור סך של שלוש שטיפות.
לאחר הכביסה הסופית, בזהירות pipette כל הביצים מן הפרפילם על חלק נקי של מגלשת מיקרוסקופ. הסר TBST עודף והוסף 20 מיקרוליטרים של מדיית הרכבה. לבסוף, מניחים מגלשת כיסוי נקי על גבי הביצים, לאטום את החלקת המכסה עם לק ברור לאחסון לטווח ארוך, ולהמשיך הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
פענוח ביצים ואחריו כתמים גרעיניים DAPI אפשר את המשימה של הפריה ומין עובר כאשר נצפה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הפרונוקלוס הנשי נמצא בסמוך למרכז הביצית הנשית המופרית והביצית הזכרית הלא מופרית, והזרע נראה כפס בהיר ליד פסגת הביצית הנשית בלבד. יישום אחד של טכניקה זו היא לקבוע אם אנדוסימביוטים חיידקיים משפיעים על יחסי המין העיקריים של whiteflies.
לדוגמה, יחסי המין העיקריים של ביצים שהונחו על ידי גחליליות B.tabici נגועות ובלתי נגועות בריקטסיה לא הראו הבדל משמעותי בין יחס המין בשני הטיפולים. באשר לביצים שגודלו לבגרות, תוצאות דומות נראו למבוגרים נגועים בריקטסיה ולא נגועים, ולא סיפקו ראיות, לפחות במחקר זה, ל שיעורי הפריה גדולים יותר על ידי נקבות נגועות ריקטסיה. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לקבוע אם זרע בין ספציפי יכול להפרות ביצים.
אם לא נצפתה הפריה, אפשר לגבות ולבדוק אם הזרע מועבר במהלך ההזדווגות על ידי התבוננות בזרע של הנקבה. אם ההפריה מתרחשת, אפשר להשוות את יחס המין של מבוגרים עם שיעור ההפריה כדי לקבוע את הכדאיות של התפתחות צאצאים היברידיים.
