Liz가 개발한 프로토콜을 통해 백색 비행 수정 속도를 결정할 수 있습니다. 이 기술을 적용하면 흰파리의 행동과 생태에 대한 이해가 향상됩니다. 백색파리는 하플로디플로이드이므로 수정속도는 배란시 성비와 동일합니다.
이 프로토콜은 백색 파리, 지식에 대해 처음 설명되었으며 3 시간 이내에 완료 할 수 있습니다. 먼저 페트리 접시 커버에 뚜껑을 덮을 수 있는 구멍을 만들어 성인 흰파리를 삽입하고 제거합니다. 편안한 작업 각도에서 얇은 핀을 녹인 파이펫 팁에 삽입하여 얇은 프로브를 만들어 습도 챔버를 설정하고 프로브를 패션화합니다.
선택적으로, 백색 도면 알의 쉽게 취급을 위해 열과 젤론 유리 파이펫 팁. 그런 다음, 여성 흰파리가 페트리 접시에 있는 한천에 맞게 잘라 깨끗한 잎에 배란을 허용합니다. 백색 플라이 배란 동안 비누와 물로 현미경 슬라이드를 청소하십시오.
잘 건조하고 액체가 방울을 형성하고 계란을 더 쉽게 볼 수 있도록 한쪽 끝에 파라핀 필름의 조각을 스트레칭. 계란을 비초하려면 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 성인 제거 및 계란 수집 직전에 파라핀 필름에 83 %의 hypochlorite 표백제 용액을 추가하십시오. 표백제와 빙하 아세트산은 모두 부식성입니다.
그들은 후드 또는 잘 통풍 지역에서 장갑으로 처리해야합니다. DAPI는 또한 자극제이며 장갑으로 처리해야합니다. 그런 다음, 잎에서 성인 흰파리를 제거하고 현미경 아래에 잎을 놓습니다.
페디셀이 잎에서 제거 될 때까지 조심스럽게 기지에서 각 계란을 들어 올립니다. 이 프로토콜을 수행하기 전에 많은 계란에서 연습하십시오. 계란을 기지에서 천천히 들어 올리고 잎에서 계란 페디셀이 제거되는 것을 볼 수 있게되면 잎에서 완전히 들어 올립니다.
표백제 한 방울에 2~3개의 달걀을 옮기고 10분 동안 그대로 둡니다. 계란을 고치려면 유리 파이펫을 사용하여 표백제를 폐기하십시오. 그런 다음 빙하 아세트산을 넣고 3분간 기다립니다.
다음으로 빙하 아세트산을 제거하고 클라크의 용액 방울을 추가합니다. 그런 다음 대부분의 솔루션이 증발할 때까지 10분 간 기다립니다. 70%에탄올 방울을 넣고 10분 동안 다시 기다립니다.
계란을 염색하려면 먼저 잔류 에탄올을 제거하십시오. 그런 다음, 7에 가까운 pH를 얻기 위해 계란에 1xPBS의 방울을 추가합니다. 건조를 방지하기 위해 습도 챔버에 현미경 슬라이드를 넣어.
30분 후 1xPBS를 제거하고 밀리리터 DAPI당 1마이크로그램의 방울을 추가합니다. 현미경 슬라이드를 어두운 습도 챔버에 넣고 적어도 15 분 기다립니다. 계란을 세척하려면 먼저 DAPI 용액을 제거하십시오.
그런 다음 계란에 1xTBST 방울을 추가합니다. 5분 후 1xTBST를 제거합니다. 총 세정제에 대해 이 세척을 두 번 더 반복합니다.
마지막 세척 후, 조심스럽게 현미경 슬라이드의 깨끗한 부분에 파라 필름에서 모든 계란을 피펫. 과도한 TBST를 제거하고 20 마이크로리터의 장착 미디어를 추가합니다. 마지막으로, 계란 위에 깨끗한 커버 슬라이드를 놓고, 장기간 보관을 위해 명확한 매니큐어로 커버 슬라이드를 밀봉하고 형광 현미경을 사용하여 이미징을 진행합니다.
DAPI 핵 염색에 선행된 계란 비초는 형광 현미경으로 관찰될 때 수정과 배아 성의 할당을 허용했습니다. 암컷 프로뉴클레우스는 수정된 암컷 계란과 수정되지 않은 수컷 계란의 중심 근처에 있으며, 정자는 여성 계란의 정점 근처에서 밝은 줄무늬로 보입니다. 이 기술의 한 응용 프로그램은 세균성 내시비바이오엔트가 흰파리의 1차 성비에 영향을 미치는지 여부를 결정하는 것입니다.
예를 들면, Rickettsia 감염되고 감염되지 않은 B.tabici 백색가에 의해 낳은 계란의 1 차적인 성비율은 2개의 처리에 있는 성비 사이 유의한 차이를 보여주지 않았습니다. 성인기에 양육 된 계란에 관해서는, Rickettsia 감염 및 감염되지 않은 성인에 대 한 유사한 결과 보였다, 증거를 제공, 적어도이 연구에서, Rickettsia 감염 된 여성에 의해 더 큰 수정 속도 대 한. 이 프로토콜을 사용 하 여, 하나는 간 특이 한 정자 계란을 수정할 수 있는지 여부를 확인할 수 있습니다.
수정이 관찰되지 않으면, 하나는 다시 여성의 정자를 보고 짝짓기 하는 동안 정자가 전송 되는지 보고 볼 수 있습니다. 수정이 발생하는 경우, 하나는 하이브리드 자손 발달의 생존가능성을 결정하기 위해 수정 속도와 성인의 성비율을 비교할 수 있습니다.
