מחקר לביולוגיה של טיפת השומנים נפגע על ידי קושי של טיהור. בנוסף, לימוד שטף השומנים התאי דורש טיהור בו זמנית של organelles מרובים, ולא פרוטוקולים פשוטים היו זמינים כיום. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא להפוך טיהור טיפת השומנים לנגיש יותר.
שינינו ערכה מסחרית זמינה כדי לבודד בו זמנית טיפות שומנים, רטיקולום אנדופלסמי, ו lysosomes מדגם אחד. הצטברות טיפת שומנים בכבד נוטה שמנים ואלכוהוליים חולים למחלות כבד מתקדמות. זה העביר את התצוגה של טיפות השומנים מתאים אחסון אינרטיים לאברונים דינמיים חשובים ביולוגית.
כדי להתחיל, להשתמש ממטרים סטריליים ומספריים ניתוח לחתוך את העור ואת שכבות השרירים של הבטן של העכבר המתת לחץ על הציר האחורי-anterior, חשיפת הכבד. חותכים את הרצועות המחברות את הכבד למעי. באמצעות מדפים, למשוך את המעי מן הכבד, לכיוון האחורי.
חותכים את הרצועה המחברת את הכבד לסרעפת. לאחר מכן, לחתוך בין הכבד ואת בית החזה הגבי, נע מן החלק האחורי האחורי, עד הכבד משוחרר. מעבירים את הכבד לצלחת פטרי קרה של חמישה סנטימטרים עם 10 מיליליטר של PBS קר 1x, ולשטוף את הכבד פעמיים על פלטפורמת נדנדה ב 10 מיליליטר של PBS 1x קר במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר הכביסה הסופית, יוצקים את 1x PBS, ולהשתמש בלהב כירורגי סטרילי בגודל 10 כדי לקוביות את הכבד לחתיכות של שלושה עד חמישה מילימטר בתוך המנה. לאחר מכן, לשטוף את הכבד קצוץ פעמיים עם 10 מיליליטר של PBS 1x קר במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. Decant PBS 1x, ולהעביר את חתיכות כבד קצוץ קר 45 מיליליטר Dounce homogenizer, להבטיח את כל החלקים נמצאים בתחתית.
הוסף שבעה מיליליטר של מאגר IE 1x קר. הומוגניזציה על הקרח על ידי הזזת העלי למעלה ולמטה 20 פעמים, לוודא כי העלי הולך לתחתית homogenizer במהלך כל שבץ. מעבירים את ההומוגנטי לצינור צנטריפוגה קר של 15 מיליליטר.
לשטוף את homogenizer עם מיליליטר אחד של חיץ IE 1x קר, ולהוסיף אותו לשאר הומוגנית. כדי להסיר גרעינים, צנטריפוגה הומוגנית בצנטריפוגה בקיבולת גבוהה ב 1, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. ודא כי כל שומנים שנאספו בחלק העליון של הצינור 15 מיליליטר הוא resuspended כדי למנוע אובדן LD.
מוודאים שהכדור הגרעיני בתחתית הצינור אינו מפריע, מעבירים את העל-טבעי הפוסט-גרעיני המכיל שומנים לצינור צנטריפוגה קר טרי של 50 מיליליטר. להעביר aliquot 100 מיקרוליטר של העל-טבעי שלאחר הגרעין לצינור מיקרוצנטריפוגה קר 1.7 מיליליטר על הקרח לניתוח טוהר מאוחר יותר. כדי להסיר מיטוכונדריה, צנטריפוגה מדגם על טבעי פוסט גרעיני בצנטריפוגה במהירות גבוהה בקירור ב 12, 000 פעמים g במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
ודא כי כל השומנים שנאספו בחלק העליון של הצינור הוא resuspended כדי למנוע אובדן LD, ולאחר מכן להעביר את העל טבעי שלאחר המיטוכונדריה לצינור אולטרהצנטריפוגה 13 מיליליטר. העבר aliquot 100 מיקרוליטר של על טבעי שלאחר המיטוכונדריה לצינור מיקרוצנטריפוגה קר 1.7 מיליליטר על קרח לניתוח טוהר מאוחר יותר. מלאו את הצינור האולטרה-מרכזי עם על-טבעי פוסט-מיטוכונדריאלי עד אפס מקום עם חיץ IE קר של 1x, כדי למנוע ממנו להתמוטט במהלך אולטרה-צנטריפוגה.
לאזן את הדגימות, ולאחר מכן צנטריפוגה אולטרהצנטריפוגה ב 100, 000 פעמים g במשך 60 דקות בארבע מעלות צלזיוס. כדי להסיר את שכבת ה- LD, הטה את הצינור בזווית של 45 מעלות ושופע עם פיפטה מזכוכית. לאחר העברת גלולה לצינור מיקרוצנטריפוגה קר 1.7 מיליליטר, לאסוף 100 microliters של על טבעי שלאחר ER מתחת לשכבת השומנים לניתוח טוהר.
כדי לסלק כל פסולת תא, צנטריפוגה במיקרוצנטריפוגה במהירות שיא במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לחמם את הצינור בעדינות עם הידיים כדי לעזור resuspend שכבת LD, ולהעביר את supernatant, כולל שכבת השומנים, לצינור microcentrifuge חדש 1.7 מיליליטר. חזור על מדרגות כביסה אלה, חימום הצינור פעמיים עד שלוש פעמים, עד גלולה כבר לא גלוי.
לאחר מכן, כדי לשטוף את גלולה ללא גלולה LD supernatant, להוסיף 1x PBS לנפח הסופי של 1.5 מיליליטר, וצנטריפוגה במיקרוצנטריפוגה במהירות שיא במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. השתמש פיפטה זכוכית כדי להסיר מיליליטר אחד של 1x PBS, אשר מתחת לשכבת השומנים, מבלי להפריע שכבת השומנים. חזור על שטיפת LD ארבע עד חמש פעמים, עד PBS 1x הוא שקוף ויזואלית ללא מערבולת.
לאחר מכן, השתמש פיפטה זכוכית כדי להסיר את כל PBS 1x מתחת לשכבת השומנים, ולהשתמש שבר LD טהור וכתוצאה מכך לניתוח במורד הזרם. כאשר נציג 20x פלואורסצנט ותמונות LD brightfield נלקחו הן בידוד LD ערכת ER ושיטות בידוד LD סוכרוז, הם חשפו רמות דומות של חומר חלקיקי, מה שמרמז על טיהורים דומים באמצעות שני פרוטוקולים שונים. לאחר הטיהור נמדדו רמות הטריגליצרידים והחלבון של LD באמצעות בדיקות קוליורימטריות, והנתונים מנורמלו למשקל הכבד, מה שמראה שכאשר החומר ההתחלתי מנורמל, תפוקת הטריגליצרידים והחלבון של LD הייתה דומה באמצעות ערכת ה- ER ושיטת הסוכרוז.
קטרים LD היו לכמת באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, מראה כי בידוד LD ערכת ER ובידוד LD סוכרוז הניב LDs בגדלים דומים. כדי להעריך את טוהר LD, דגימות הוערכו על ידי immunoblotting, מראה כי LDs נגזר בידוד LD ערכת ER ואת פרוטוקול שיפוע סוכרוז שניהם היו טוהר שווה. PLIN2, סמן LD, זוהה בכל הדגימות למעט בידוד LD ערכת ER PER ו- PNS של סוכרוז.
ניתוח טוהר של שבר ER באמצעות immunoblots מראה כי הם היו ללא סמן LD PLIN2 אבל היו רמות משמעותיות של חלבון ER SEC61A. טוהר של שבר lysosomal לאחר טיהור נוסף של lysosomes באמצעות ערכת העשרה lysosome הוערך גם. גילוי הוא כרגע היישום השימושי ביותר של הפרוטוקול שלנו.
אנו מבצעים ליפידומיים באברונים מטוהרים, והראה ליפוטוקסינים מוגברים במיוחד טיפות השומנים במחלת כבד אלכוהולית.
