Die Erforschung der Lipidtropfenbiologie wurde durch Reinigungsschwierigkeiten behindert. Darüber hinaus erfordert das Studium des zellulären Lipidflusses die gleichzeitige Reinigung mehrerer Organellen, und es waren derzeit keine einfachen Protokolle verfügbar. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, die Fetttropfenreinigung zugänglicher zu machen.
Wir modifizierten ein kommerziell erhältliches Kit, um gleichzeitig Lipidtröpfchen, endoplasmatisches Retikulum und Lysosomen aus einer einzigen Probe zu isolieren. Leberlipid Tröpfchen Akkumulation prädisponiert adipöse und alkoholische Patienten zu progressiven Lebererkrankungen. Dies hat den Blick auf Lipidtröpfchen von inerten Staufächern auf dynamische biologisch wichtige Organellen verlagert.
Verwenden Sie zunächst sterile Zangen und Sezierscheren, um die Haut- und Muskelschichten des Bauches der eingeschläferten Maus auf der hinteren vorderen Achse zu schneiden und die Leber freizulegen. Schneiden Sie die Bänder, die die Leber mit dem Darm verbinden. Mit Zangen, ziehen Sie den Darm weg von der Leber, in Richtung der hinteren.
Schneiden Sie das Band, das die Leber mit dem Zwerchfell verbindet. Dann zwischen der Leber und dem rückenden Brustkorb schneiden, von vorn zu hinter, bis die Leber befreit ist. Die Leber auf eine kalte Fünf-Zentimeter-Petrischale mit 10 Millilitern kalten 1x PBS übertragen und die Leber zweimal auf einer Schaukelplattform in 10 Milliliter kaltem 1x PBS für fünf Minuten bei vier Grad Celsius waschen.
Nach der letzten Wäsche, gießen Sie die 1x PBS, und verwenden Sie eine Größe-10 sterile chirurgische Klinge, um die Leber in drei bis fünf Millimeter Stücke innerhalb der Schale zu würfeln. Dann waschen Sie die gewürfelte Leber zweimal mit 10 Milliliter kalte 1x PBS für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Dekantieren Sie die 1x PBS, und übertragen Sie die gewürfelten Leberstücke auf einen kalten 45-Milliliter Dounce Homogenisator, um sicherzustellen, dass sich alle Teile am Boden befinden.
Fügen Sie sieben Milliliter kalten 1x IE Puffer hinzu. Homogenisieren Sie auf Eis, indem Sie den Stößel 20 Mal nach oben und unten bewegen, um sicherzustellen, dass der Stößel bei jedem Schlag auf den Boden des Homogenisators geht. Das Homogenat in ein kaltes 15-Milliliter-Zentrifugenrohr geben.
Spülen Sie den Homogenisator mit einem Milliliter kalten 1x IE Puffer, und fügen Sie ihn dem Rest des Homogenats hinzu. Um Die Kerne zu entfernen, zentrieren Sie das Homogenat in einer Hochleistungszentrifuge bei 1 000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Stellen Sie sicher, dass alle Lipide, die oben in der 15-Milliliter-Röhre gesammelt werden, resuspendiert werden, um LD-Verlust zu verhindern.
Um sicherzustellen, dass das Kernpellet an der Unterseite des Rohres ungestört ist, übertragen Sie den lipidhaltigen postnuklearen Überstand in ein frisches kaltes 50-Milliliter-Zentrifugenrohr. Übertragen Sie ein 100-Mikroliter-Aliquot des postnuklearen Überstandes auf ein kaltes 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr auf Eis für eine spätere Reinheitsanalyse. Um Mitochondrien zu entfernen, zentrifugieren Sie die post-nukleare Überstandprobe in einer gekühlten Hochgeschwindigkeitszentrifuge bei 12.000 mal g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius.
Stellen Sie sicher, dass alle lipide, die an der Oberseite des Rohres gesammelt werden, resuspendiert wird, um LD-Verlust zu verhindern, und übertragen Sie dann den post-mitochondrialen Überstand auf ein 13-Milliliter-Ultrazentrifugenrohr. Übertragen Sie einen 100-Mikroliter-Aliquot des post-mitochondrialen Überstandes auf ein kaltes 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr auf Eis zur späteren Reinheitsanalyse. Füllen Sie das Ultrazentrifugenrohr mit post-mitochondrialem Überstand bis zum Rand mit kaltem 1x IE Puffer, um zu verhindern, dass es während der Ultrazentrifugation zusammenbricht.
Die Proben ausbalancieren und dann in einer Ultrazentrifuge bei 100.000 mal g 60 Minuten bei vier Grad Celsius zentrieren. Um die LD-Schicht zu entfernen, neigen Sie das Rohr in einem 45-Grad-Winkel, und aspirieren Sie mit einer Glaspipette. Nach der Übertragung des Pellets in ein kaltes 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr, sammeln Sie 100 Mikroliter des Post-ER-Überstandes unter der Lipidschicht für die Reinheitsanalyse.
Um Zellablagerungen zu pellet, Zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Dann wärmen Sie das Rohr sanft mit den Händen, um die LD-Schicht wieder aufzuhängen, und übertragen Sie den Überstand, einschließlich der Lipidschicht, auf ein neues 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Wiederholen Sie diese Waschschritte, wärmen Sie das Rohr zwei- bis dreimal, bis das Pellet nicht mehr sichtbar ist.
Um dann den pelletfreien LD-Überstand zu waschen, fügen Sie 1x PBS zu einem Endvolumen von 1,5 Millilitern hinzu und zentrifugieren Sie in einer Mikrozentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie eine Glaspipette, um einen Milliliter 1x PBS zu entfernen, der sich unter der Lipidschicht befindet, ohne die Lipidschicht zu stören. Wiederholen Sie das WASCHEN von LD vier- bis fünfmal, bis die 1x PBS optisch transparent und ohne Trübung ist.
Verwenden Sie dann eine Glaspipette, um alle 1x PBS unterhalb der Lipidschicht zu entfernen, und verwenden Sie die resultierende reine LD-Fraktion für die nachgeschaltete Analyse. Als repräsentative 20x fluoreszierende und hellfeldfarbene LD-Bilder sowohl aus der ER-Kit-LD-Isolierung als auch aus den Sukzessa-LD-Isolationsmethoden aufgenommen wurden, zeigten sie ähnliche Feinstaubwerte auf, was auf ähnliche Reinheitsgrade mit zwei verschiedenen Protokollen hindeutet. Nach der Reinigung wurden LD-Triglycerid- und Proteinspiegel mit kolorimetrischen Assays gemessen, und die Daten wurden auf das Lebergewicht normalisiert, was zeigt, dass bei normalisiertem Ausgangsmaterial die LD-Triglycerid- und Proteinerträge mit dem ER-Kit und der Saccharosemethode ähnlich waren.
LD-Durchmesser wurden mit Hilfe einer Bildanalyse-Software quantifiziert, was zeigt, dass die ER-Kit-LD-Isolierung und die Saccharose-LD-Isolierung LDs ähnlicher Größen ergaben. Zur Beurteilung der LD-Reinheit wurden Proben durch Immunoblotting untersucht, was zeigte, dass die lDs, die aus der ER-Kit-LD-Isolierung und dem Saccharosegradientenprotokoll abgeleitet wurden, beide die gleiche Reinheit hatten. PLIN2, ein LD-Marker, wurde in allen Proben mit Ausnahme des ER-Kits LD-Isolationper und des PNS der Saccharose nachgewiesen.
Die Reinheitsanalyse einer ER-Fraktion mit Immunoblots zeigt, dass sie frei von LD-Marker PLIN2 waren, aber signifikante Konzentrationen des ER SEC61A-Proteins hatten. Die Reinheit einer lysosomalen Fraktion nach weiterer Reinigung von Lysosomen mit dem Lysosomenanreicherungskit wurde ebenfalls bewertet. Discovery ist derzeit die nützlichste Anwendung unseres Protokolls.
Wir führen Lipidomik in gereinigten Organellen durch und zeigten, dass Lipotoxine speziell bei Lipidtröpfchen bei alkoholischen Lebererkrankungen erhöht werden.
