Исследования в биологии липидных капель затрудняется сложностью очистки. Кроме того, изучение клеточного липидного потока требует одновременной очистки нескольких органелл, и в настоящее время не существует простых протоколов. Основным преимуществом этой техники является сделать очистку липидных капель более доступной.
Мы модифицировали коммерчески доступный комплект для одновременной изоляции липидных капель, эндоплазмического цитокулума и лизосом из одного образца. Накопление липидных капель печени предрасполагает пациентов с ожирением и алкоголизмом к прогрессирующим заболеваниям печени. Это сместило представление о липидных каплях из инертных отсеков для хранения в динамические биологически важные органеллы.
Для начала используйте стерильные миппы и ножницы для вскрытия, чтобы сократить кожу и мышечные слои живота усыпленной мыши на задней передней оси, обнажая печень. Разрежьте связки, соединяющие печень с кишечником. Используя миппы, вытяните кишечник от печени, к задней.
Отрежьте связку соединяя печеночную к диафрагме. Затем разрезают между печенью и спинной грудной клеткой, переходя от передней к задней, пока печень не будет освобождена. Перенесите печень в холодную пятисемейметровую чашку Петри с 10 миллилитров холодного 1x PBS, и мыть печень дважды на качалке платформы в 10 миллилитров холодного 1x PBS в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
После окончательного мытья, слить 1x PBS, и использовать размер-10 стерильных хирургических лезвие кости печени на три-пять миллиметров штук в блюдо. Затем, мыть кубиками печени два раза с 10 миллилитров холодного 1x PBS в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию. Декант 1x PBS, и передать нарезанные кубиками кусочки печени в холодный 45-миллилитровый гомогенизатор Dounce, гарантируя, что все части находятся на дне.
Добавьте семь миллилитров холодного буфера 1x IE. Гомогенизировать на льду, перемещая пестик вверх и вниз 20 раз, убедившись, что пестик идет на дно гомогенизатора во время каждого инсульта. Перенесите гомогенат в холодную 15-миллилитровую центрифугу.
Промыть гомогенизатор с одним миллилитр холодного буфера 1x IE, и добавить его к остальной части гомогената. Чтобы удалить ядра, центрифуга гомогената в центрифуге высокой емкости при 1000 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Убедитесь, что любой липид, собранный в верхней части 15-миллилитровой трубки повторно, чтобы предотвратить потерю LD.
Убедившись, что ядерные гранулы на дне трубки нетронуты, перенесите липидосодержащую постядерную супернатантную трубку в свежую холодную 50-миллилитровую центрифугу. Перенесите 100-микролитровую алицитат постядерного супернатанта в холодную 1,7-миллилитровую микроцентрифугную трубку на льду для более длительного анализа чистоты. Чтобы удалить митохондрии, центрифуза постядерного супернатанта образца в охлажденной высокоскоростной центрифуге при 12000 раз г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.
Убедитесь, что любой липид, собранный в верхней части трубки повторно, чтобы предотвратить потерю LD, а затем передать пост-митохондриальный супернатант в 13-миллилитровый ультрацентрифуг трубки. Перенесите 100-микролитр-алицит после митохондриального супернатанта в холодную 1,7-миллилитровую микроцентрифугную трубку на льду для более длительного анализа чистоты. Заполните ультрацентрифугную трубку пост-митохондриальным супернатантом до краев с помощью холодного буфера 1x IE, чтобы предотвратить его коллапс во время ультрацентрифугации.
Сбалансировать образцы, а затем центрифугу в ультрацентрифуге при 100 000 раз г в течение 60 минут при четырех градусах Цельсия. Чтобы удалить слой LD, наклоните трубку под углом 45 градусов и аспират со стеклянной пипеткой. После переноса гранулы в холодную 1,7-миллилитровую микроцентрифуговую трубку, соберите 100 микролитров супернатанта после ЭР под липидным слоем для анализа чистоты.
Чтобы гранулировать любой клеточный мусор, центрифуга в микроцентрифуге на высокой скорости в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Затем аккуратно разогрейте трубку руками, чтобы помочь повторно использовать слой LD, и перенесите супернатант, включая липидный слой, в новую 1,7-миллилитровую микроцентрифугную трубку. Повторите эти шаги мытья, нагревая трубку два-три раза, пока гранулы больше не видны.
Затем, чтобы вымыть гранулы без LD supernatant, добавить 1x PBS к окончательному объему 1,5 миллилитров, и центрифуга в микроцентрифуге на высокой скорости в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Используйте стеклянную пипету, чтобы удалить один миллилитр 1x PBS, который находится под липидным слоем, не нарушая липидный слой. Повторите LD стирки четыре-пять раз, пока 1x PBS визуально прозрачным без мутности.
Затем используйте стеклянную пипету, чтобы удалить все 1x PBS ниже липидного слоя, и использовать полученную чистую фракцию LD для анализа вниз по течению. Когда репрезентативные 20x флуоресцентные и яркие изображения LD были взяты из изоляции ER комплект LD и методы изоляции сахарозы LD, они показали аналогичные уровни твердых частиц, предлагая аналогичные чистоты с использованием двух различных протоколов. После очистки, LD триглицеридов и белковых уровней были измерены с помощью колориметрических анализов, и данные были нормализовываться до веса печени, показывая, что, когда стартовый материал был нормализован, LD триглицеридов и белковых урожаев были похожи с помощью набора ER и метод сахарозы.
Диаметры LD были количественно определены с помощью программного обеспечения анализа изображений, показывая, что изоляция комплекта LD ER и изоляция сахарозы LD дали LDs аналогичных размеров. Для оценки чистоты LD, образцы были анализированы иммуноблоттинга, показывая, что ЛСД, полученные из изоляции комплекта ER LD и протокола градиента сахарозы оба имели равную чистоту. PLIN2, маркер LD, был обнаружен во всех образцах, за исключением изоляции ER комплекта LD PER и PNS сахарозы.
Анализ чистоты фракции ER с использованием иммуноблотов показывает, что они были свободны от маркера LD PLIN2, но имели значительные уровни белка ER SEC61A. Была также оценена чистота лизосомальной фракции после дальнейшей очистки лизосом, использующих набор для обогащения лизосом. Discovery в настоящее время является наиболее полезным применением нашего протокола.
Мы выполняем липидомику в очищенных органеллах, и показали, липотоксины увеличились специально в липидных капель при алкогольных заболеваниях печени.
