La recherche sur la biologie des gouttelettes lipidiques a été entravée par des difficultés de purification. En outre, l’étude du flux lipidique cellulaire nécessite la purification simultanée de plusieurs organites, et aucun protocole simple n’était actuellement disponible. Le principal avantage de cette technique est de rendre la purification des gouttelettes lipidiques plus accessible.
Nous avons modifié un kit disponible dans le commerce pour isoler simultanément les gouttelettes lipidiques, le réticulum endoplasmique et les lysosomes à partir d’un seul échantillon. L’accumulation de gouttelettes de lipides hépatiques prédispose les patients obèses et alcooliques à une maladie hépatique progressive. Cela a déplacé la vue des gouttelettes lipidiques des compartiments de stockage inertes aux organites dynamiques biologiquement importants.
Pour commencer, utilisez des forceps stériles et des ciseaux de dissection pour couper la peau et les couches musculaires de l’abdomen de la souris euthanasiée sur l’axe postérieur-antérieur, exposant le foie. Couper les ligaments reliant le foie à l’intestin. À l’aide de forceps, tirez l’intestin loin du foie, vers le postérieur.
Couper le ligament reliant le foie au diaphragme. Ensuite, couper entre le foie et la cage thoracique dorsale, passant de l’antérieur au postérieur, jusqu’à ce que le foie soit libéré. Transférer le foie dans une boîte de Pétri froide de cinq centimètres avec 10 millilitres de 1x PBS froid, et laver le foie deux fois sur une plate-forme de basculement en 10 millilitres de froid 1x PBS pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Après le lavage final, versez le 1x PBS, et utilisez une lame chirurgicale stérile de taille 10 pour couper le foie en morceaux de trois à cinq millimètres dans le plat. Ensuite, lavez le foie en dés deux fois avec 10 millilitres de 1x PBS froid pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Décanter le 1x PBS, et transférer les morceaux de foie en dés à un homogénéiseur dounce froid de 45 millilitres, en veillant à ce que tous les morceaux sont au fond.
Ajouter sept millilitres de tampon froid 1x IE. Homogénéiser sur la glace en déplaçant le pilon de haut en bas 20 fois, en s’assurant que le pilon va au fond de l’homogénéiseur au cours de chaque course. Transférer l’homogénéité dans un tube de centrifugeuse froid de 15 millilitres.
Rincer l’homogénéiseur avec un millilitre de tampon froid 1x IE, et l’ajouter au reste de l’homogénéité. Pour enlever les noyaux, centrifugez l’homogénéisation dans une centrifugeuse de grande capacité à 1000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Assurez-vous que tous les lipides recueillis au sommet du tube de 15 millilitres sont résuspendus pour éviter la perte de LD.
En s’assurant que la pastille nucléaire au fond du tube n’est pas perturbée, transférez le supernatant postnucléique contenant des lipides dans un tube de centrifugeuse froid frais de 50 millilitres. Transférer un aliquot de 100 microlitres du supernatant post-nucléaire dans un tube de microcentrifugeuse froid de 1,7 millilitre sur la glace pour une analyse de pureté ultérieure. Pour enlever les mitochondries, centrifugez l’échantillon de supernatant post-nucléaire dans une centrifugeuse réfrigérée à grande vitesse à 12 000 fois g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.
Assurez-vous que tous les lipides recueillis au sommet du tube sont résuspendus pour prévenir la perte de LD, puis transférez le supernatant post-mitochondrial dans un tube ultracentrifugeuse de 13 millilitres. Transférer un aliquot de 100 microlitres du supernatant post-mitochondrial dans un tube de microcentrifugeuse froid de 1,7 millilitre sur la glace pour une analyse de pureté ultérieure. Remplissez le tube d’ultracentrifugeuse d’un supernatant post-mitochondrial à ras bord d’un tampon 1x IE froid, pour éviter qu’il ne s’effondre pendant l’ultracentrifugation.
Équilibrez les échantillons, puis centrifugez dans une ultracentrifugeuse à 100 000 fois g pendant 60 minutes à quatre degrés Celsius. Pour enlever la couche LD, inclinez le tube à un angle de 45 degrés et aspirez avec une pipette en verre. Après avoir transféré la pastille dans un tube de microcentrifugeuse froid de 1,7 millilitre, recueillir 100 microlitres du supernatant post-ER sous la couche lipidique pour l’analyse de la pureté.
Pour pelleter les débris cellulaires, centrifugeuse dans une microcentrifugeuse à grande vitesse pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, réchauffez doucement le tube avec les mains pour aider à resuspendre la couche LD, et transférer le supernatant, y compris la couche lipidique, à un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,7 millilitre. Répétez ces étapes de lavage, en chauffant le tube deux à trois fois, jusqu’à ce que la pastille ne soit plus visible.
Ensuite, pour laver le supernatant LD sans granulés, ajouter 1x PBS à un volume final de 1,5 millilitres, et centrifugeuse dans une microcentrifugeuse à grande vitesse pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Utilisez une pipette en verre pour enlever un millilitre de 1x PBS, qui est sous la couche lipidique, sans perturber la couche lipidique. Répétez le lavage LD quatre à cinq fois, jusqu’à ce que le 1x PBS soit visuellement transparent sans turbidité.
Ensuite, utilisez une pipette en verre pour enlever tous les 1x PBS sous la couche lipidique, et utilisez la fraction LD pure résultante pour l’analyse en aval. Lorsque des images LD fluorescentes et brillantes représentatives 20x ont été prises à la fois à partir de l’isolement du kit ER LD et des méthodes d’isolement du saccharose LD, elles ont révélé des niveaux similaires de particules, suggérant des puretés similaires en utilisant deux protocoles différents. Après purification, les niveaux de triglycérides et de protéines du LD ont été mesurés à l’aide d’analyses colorimétriques, et les données ont été normalisées au poids du foie, ce qui montre que lorsque le matériau de départ a été normalisé, les rendements en triglycérides et en protéines du LD étaient similaires à l’aide du kit d’urgence et de la méthode du saccharose.
Les diamètres de LD ont été quantifiés à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image, montrant que l’isolement du kit ER LD et l’isolement du saccharose LD ont donné des LD de tailles similaires. Pour évaluer la pureté de LD, des échantillons ont été analysés par immunoblotting, montrant que les LD dérivés de l’isolement de kit d’urgence LD et le protocole de gradient de saccharose ont tous deux eu la pureté égale. PLIN2, un marqueur LD, a été détecté dans tous les échantillons, sauf pour le kit ER LD isolation PER et le PNS du saccharose.
L’analyse de pureté d’une fraction d’ER utilisant des immunoblots montre qu’ils étaient exempts du marqueur de LD PLIN2 mais ont eu des niveaux significatifs de la protéine ER SEC61A. La pureté d’une fraction lysosomale après la purification supplémentaire des lysosomes utilisant le kit d’enrichissement de lysosome a été également évaluée. Discovery est actuellement l’application la plus utile de notre protocole.
Nous effectuons des lipidomics dans les organites purifiés, et avons montré que les lipotoxines sont augmentées spécifiquement dans les gouttelettes de lipide dans la maladie hépatique alcoolique.
