המטרה הכללית של הליך זה היא לפקח על שינויים בריכוזי סידן ציטוזוליים בתאים חיים כדי להבדיל בין תגובות עצביות או גליה המבוססות על אשלגן כלורי, או גירויי ATP. סידן הוא שליח שני חשוב המעורב במספר תהליכים תאיים, כולל עצבית, פלסטיות ואפופטוזיס. הופעתם של צבע סידן פלואורסצנטי סלקטיבי גבוה, כגון Fura-2 AM, הקשורים לפיתוח מיקרוסקופים פלואורסצנטיים טובים יותר ושיטות חישוב, הניבה נתונים אופטיים ברזולוציה גבוהה עם רמה גבוהה של רזולוציה מרחבית וטמפורלית כדי לדמות סידן איתות על תאים חיים ואורגניזמים.
פרוטוקול זה מותאם לנוירונים מועשרים, גליה מטוהרת או תרבויות אוכלוסייה מעורבות. הוא עוקב אחר סוגי התאים שהגיבו לגירויים מוגדרים בהתבסס על התגובה הדיפרנציאלית לאשלגן כלורי ו- ATP. אשלגן כלורי משנה את פוטנציאל הממברנה של התא.
וזה פותח את תעלות הסידן המגודרות במתח, שבאות לידי ביטוי בעיקר על ידי נוירונים. מצד שני, ATP מפעיל P2X7 ערוץ חלק גדול, נוכח בעיקר בתאי גליה. על ידי צימוד אשלגן כלורי וגירויים ATP עם תרופות אחרות, ניתן לראות איזה תא של מערכת העצבים מגיב אליהם, בהתבסס על עלייה של ריכוז סידן תאיים.
עבור הליך זה, תצטרך כמה מכשירים כירורגיים או פינצטה. השתמש בארון בטיחות ביולוגית ובצע את שיטות העבודה המומלצות כדי למנוע זיהום. כדי להתחיל את תרבות רשתית העוף, פתחו בזהירות ביצה מופרית בתחתית, שם נמצא תא האוויר.
מוציאים את התכולה לצלחת פטרי וממשיכים בתרומת העובר על ידי עריפת ראש עם זוג פינצטה. לאחר הסרת הראש, להביא אותו לצלחת פטרי נקייה ולהוסיף קצת פתרון ללא סידן ומגנזיום אליו. לאחר מכן, להסיר את העיניים, הקפדה לא לפגוע בהם בתהליך.
הביאו את העין למנת פטרי אחרת המכילה תמיסת CMF. עם זוג פינצטה, להתחיל לנתח את העין על ידי הסרת העדשה. לאחר מכן, החל מהחור שהשאירה העדשה, בצע שלושה או ארבעה חתכים אורך בעין.
הסר את הגוף הזגוגי השקוף בזהירות. ודא שהרשתית אינה נקשרת אליו. לאחר מכן, לנתק בעדינות את הרשתית מן האפיתל פיגמנטי.
הסר את כל רקמת האפיתל שנותרה. כאשר הרשתית ברורה לחלוטין, חותכים אותה לחתיכות קטנות. קח את כל רקמת הרשתית בעזרת פיפטה אוטומטית.
צנטריפוגה קצרה הרשתית כדי להסיר את כל CMF. הוסף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין. ולדגור על הרקמה ב 37 C במשך 10 דקות.
עצור תגובת טריפסין על ידי הוספת 1 מ"ל של מדיום המכיל 10% סרום עגל עוברי. צנטריפוגה הרשתית כדי להסיר את כל הטריפסין. לשטוף את התאים פעמיים או שלוש פעמים עם בינוני המכיל 10%FCS.
לאחר מכן, להוסיף 2 מ"ל של בינוני לכל רשתית בעדינות לנתק אותו באופן מכני. לדלל את התאים, כך שתוכל לספור אותם כראוי עם hemocytometer. יש להשתמש בכיסויים בקוטר 15 מ"מ המוגנים באמצעות פולי-L-ליזין ולמנין כדי לסייע בהידבקות תאים.
פיפטה 50 L של התאים המדוללים שלך על כל כיסוי. דגירה התאים ב 37 C ב 5% CO2 אטמוספרה. ולקרר אותם כדי לחבר את הכוס.
זה אמור לקחת בערך שעה עד שעתיים. מוסיפים 1 מ"ל של בינוני ומחזירים אותו לאינקובטור עד יום הניסוי. במידת הצורך לשנות חצי מהמדיום כל יומיים עד שלושה ימים.
לשקם בקבוקון 50 גרם של פורה-2 AM עם 50 L של DMSO. פתרון קרבס הוא אפשרות טובה להעביר תאים במהלך הניסוי, כי זה לא מפריע למדידת פלואורסצנטיות. מחממים את הפתרון ל-37 לפני שמתחילים.
הוסף פולוקסמר 407. הוסף Fura-2 AM ו- DMSO. Sonicate אותו במשך שבע דקות באמבט מים.
הכן צלחת 6-well הוספת פתרון קרבס לשלוש בארות ואת פתרון Fura-2 עובד על אחר. לשטוף את כיסוי מכילים את התאים שלך שלוש פעמים לפני הוספת פורה-2 היטב. דגירה התאים ב 37 C ו 5% CO2 אטמוספרה במשך 30 דקות באינקובטור כהה.
לאחר הדגירה, לשטוף אותו שלוש פעמים שוב. העבר אותו לנמען אחר המכיל קרבס והגן עליו מפני האור. ניתן לעשות שימוש חוזר בפורה-2 המוכן כדי לדגור על כיסויים נוספים עם תאים.
הוסיפו סיליקון לתמיכה ולתא כיסוי לפני כל ריצה כדי למנוע דליפת פתרון. הוציאו את כיסוי הכיסוי מתמיסת קרבס ושטפו בזהירות את התחתית במים מזוקקים כדי למנוע התגבשות מלח בעדשת המיקרוסקופ. שים את כיסוי על התמיכה, לחיצה על הגבולות בזהירות.
חברו את התמיכה והתא של כיסוי למיקרוסקופ, והתחילו לנפח את התאים עם תמיסת קרבס. בחר תאים מתאימים ובחר שדה טוב. קבע באופן ידני את אזורי העניין על ידי בחירת גופי תאים בהתבסס על המורפולוגיה הייחודית שלהם.
הווריאציות של ריכוז הסידן הוערכו על ידי כימות היחס של פלואורסצנטיות הנפלטת ב 510 ננומטר לאחר עירור חלופי ב 340 ו 380 ננומטר. לאחר הוספת אשלגן כלורי ניתן לראות תאים רבים זוהרים ותגובת הפלואורסצנטיות עולה על הגרף. אשלגן כלורי פותח תעלות סידן מגודרות מתח, מציג בעיקר נוירונים.
כל קו בודד בגרף מייצג את אזור העניין הייחודי. לכן, ניתן לעקוב אחר תגובות תאים בודדים במהלך הניסוי. גירויי ATP פותח קולטן P2X7, שבא לידי ביטוי בעיקרו על ידי תאי גליה.
זוהי תרבות נוירונים מועשרת. לכן, יש כמה תאי גליה כאן. זו הסיבה מדוע כל כך מעט תאים מגיבים לגירויים ATP.
ערכים שנרכשו עובדו באמצעות תוכנת Metafluor. תוצאות ניסיוניות מבוטאות בטבלת Excel, שבה כל שורה מייצגת תא בודד, וכל שורה, נקודת זמן. באמצעות תוכנת Excel, ניתן להתוות וריאציות סידן של תאים בודדים בנפרד, או של כולם באותו גרף.
כדי לכמת את כמות התאים הריאקטיביים לכל גירוי, הגדר ניתוק של 30% הגדלת רמות הסידן הבסיסיות. כאן אנו משתמשים בתאי רשתית בתרבית מהיום העוברי 8 אפרוחים כדי לחקור כיצד נוירונים וגליה מאותתים במונחים של משמרות סידן, לאחר קבלת 50 מ"מ אשלגן כלורי וגירויים ATP 1 מ"מ. בכל ניסוי, כ -100 תאים נותחו בקלות.
איור A מייצג תרבות מעורבת המכילה גם נוירונים וגם גליה, שנשמרה במשך שבוע. כאשר אנו מכמתים את התגובות, ניתן לראות כי כמחצית מהתאים המנותחים עונים על אשלגן כלורי, והחצי השני הגיב ל- ATP. איור B מתייחס לתרבות מועשרת בנוירונים.
זה היה דגירה במשך שלושה ימים בלבד, ולכן, רוב תאי גליה לא הבדיל עדיין. במקרה זה, 89% מהתאים עונים על אשלגן כלורי, ומחזקים את השכיחות של נוירונים. איור C מראה תרבות גליה מטוהרת.
תאים אלה נשמרו במשך 10 ימים עם שינויים בינוניים כל שלושה ימים. לאחר מכן רוב הנוירונים מתים, משאירים רק גליה. ואכן, תרבות זו הופעלה אך ורק על ידי ATP.
מתודולוגיה זו שימשה באופן נרחב בשל המאפיינים האוניברסליים של סידן כשליח שני. הניתוח פנוטיפי יכול להיות משופר על ידי מחמאה מתודולוגיה זו עם אימונוכימיה של תאים קבועים לאחר הדמיית סידן. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם גם למערכות תאים מעורבים אחרים המבטאים תעלות סידן אחרות.
הטיפ החשוב הוא למצוא תגובות סלקטיביות של סוגים שונים של תאים בקורלציה עם הביטוי הפנוטיפי שלהם.
