표적 참여의 평가, 즉, 약물과의 약물의 상호 작용은 약물 개발또는 기초 연구 프로젝트에서 임의의 화합물의 생물학적 활성해석을 위한 기본 요건이다. 이 기술의 주요 장점은 히스톤 마크 및 발현과 같은 다운스트림 효과의 측정보다는 KDM1A 대상 참여의 용량 효과 및 역학을 직접 측정할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 기초 연구및 또한 임상 시험에서, 종양학 CNS 또는 약리학을 공부하기 위하여 KDM1A 억제제로 처리를 받는 그밖 질병에서 적용될 수 있습니다.
이 기술은 ORY-1001, iadademstat를 연구하기 위해 개발된 화학 프로브를 기반으로 하지만, 다른 KDM1A 억제제에 실제로 사용될 수 있으며 전략은 다른 표적에 적용될 수 있다. 절차는 Raquel Ruiz에 의해 입증됩니다, 내 실험실에서 PK / PD 발견 플랫폼의 운영 관리자. ORY-1001을 사용하여 세포 치료 하는 동안 화합물은 핵에 존재 하는 KDM1A 단백질에 결합.
이 절차를 시작하려면 냉장고에서 20 밀리머 바이오티네이트 프로브 OG-881 스톡 솔루션의 10 마이크로리터 일회용 알리쿼트를 검색하고 실온에서 10 분 동안 따뜻하게하십시오. 필터 팁이 있는 마이크로파이프를 사용하여 재고 용액을 일련적으로 희석하여 두 개의 마이크로몰러 작동 솔루션을 준비합니다. 다음으로, 마이크로센티슈에이처 튜브에 PBS의 1밀리리터에 프로테아제 억제제 1정을 용해한다.
화학 프로브와 1x 세포 용해 버퍼의 원하는 부피의 각 밀리리터에 대해, 상업적으로 얻은 10x 세포 용해 버퍼의 100 마이크로리터, 10x 프로테아제 억제제의 150 마이크로리터, 2개의 마이크로몰라 OG-881 작업 용액의 12.5 마이크로리터 및 737.5 마이크로리터를 혼합한다. 세포는 어떤 무료 KDM1A 단백질에 결합하는 화학 프로브의 존재에 1 x lysis 완충제에서 lysed. 조직에서 준비하려면 마른 얼음에 차가운 박격포와 유봉을 사용하여 냉동 조직의 1 입방 센티미터 조각을 분쇄하고 균질화하십시오.
Aliquot 는 조직을 일회용 바이알로 인용하여 항상 해동을 피하면서 약 40 밀리그램의 조직 분말을 각 유리병으로 옮기십시오. 처리 준비가 될 때까지 샘플을 섭씨 80도에 저장합니다. 세포 펠릿에서 준비하기 위하여는, 25 나노몰라 OG-881를 포함하는 1x 세포 용해 완충제의 200 마이크로리터에서 대략 1,000만 개의 세포의 펠릿을 재중단합니다.
각 샘플을 간략하게 소용돌이시키고 5 분 동안 얼음에 보관하십시오. 초음파 처리기는 각각 20 초 동안 지속되는 45 킬로 헤르츠에서 세 개의 펄스로 샘플을 초음파 처리합니다. 샘플을 펄스 사이에 20초 동안 얼음 위에 놓습니다.
샘플을 얼음 위에 5분 더 보관하십시오. 그런 다음, 소용돌이를 짧게 원심분리하고 4°C에서 미리 냉각되는 원심분리기에서 10분 동안 14, 000배 G로 샘플을 원심분리합니다. 1 밀리리터 마이크로파이프를 사용하여 각 체판을 별도의 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 옮기는다.
처리하기 전에 2 시간 동안 튜브를 얼음에 둡니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 브래드포드 분석체를 사용하여 네이티브 단백질을 정량화합니다. 총 플레이트는 항 KDM1A 항체로 코팅된다.
프리 플레이트는 스트렙타비딘으로 코팅되어 있습니다. 세포 용해는 플레이트 와 KDM1A 복합체모두에 첨가되어 직접 또는 화학 프로브를 통해 포획된다. 플레이트는 안티 KDM1A 검출 항체와 고추냉이 과산화제에 결합된 이차 항체로 세척 및 배양된다.
마지막으로 발광 기판이 추가되고 신호가 생성됩니다. 총 KDM1A ELISA의 경우, PBS에서 10밀리리터의 KDM1A 포획 항체를 각 플레이트당 밀리리터당 2마이크로그램의 최종 농도로 준비한다. 100 마이크로리터를 접시의 각 우물로 옮기.
무료 KDM1A ELISA의 경우 PBS에서 각 플레이트당 밀리리터당 10 마이크로그램의 농도로 10밀리리터의 스트렙타비딘을 준비하십시오. 100 마이크로리터를 접시의 각 우물로 옮기. 그런 다음 각 플레이트에 접착제 필름으로 상단 을 밀봉하고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
다음 날, 냉장고에서 접시를 제거하고 약 45 분 동안 실온에서 평형하자. 세척 버퍼로 각 접시를 세 번 씻고, 세척 단계마다 접시를 탭하여 잔류 용액을 제거하십시오. 두 플레이트의 각 웰에 200 마이크로리터의 블로킹 버퍼를 추가합니다.
상단 접착제 필름으로 접시를 밀봉하고 2 시간 동안 실온에서 배양. 한편, 이전에 획득한 원토단백질 추출물을 PBS로 희석하여 적절한 농도로 희석하고, 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 인간 rKDM1A를 사용하여 표준 곡선을 준비하는 플레이트를 배치한다. 2시간 의 인큐베이션이 완료된 후 블로킹 버퍼를 버리고 세척 버퍼로 접시를 세척하여 세척 버퍼로 세척하여 세척 단계마다 세척 단계마다 플레이트를 탭하여 잔류 용액을 제거하십시오.
텍스트 프로토콜의 표 2에서 발견되는 플레이트 분포에 따라 적절한 희석 된 샘플을 냉장 96 깊이 의 저장 블록으로 전송합니다. 텍스트 프로토콜의 표 3에서 발견되는 플레이트 분포에 따라 총 및 무료 ELISA 플레이트에 잘 100 마이크로 리터를 파이펫하는 동안 얼음에이 블록을 유지합니다. 실온에서 1시간 동안 배양한 다음 샘플을 버리고 세척 버퍼로 접시를 5번 세척합니다.
밀리리터당 0.125 마이크로그램의 농도로 버퍼를 차단하는 토끼 안티-KDM1A 검출 항체 20 밀리리터를 준비한다. 음극제에 대응하는 것을 제외하고, 검출 항체 용액 100마이크로리터를 두 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 상단 접착제 필름으로 접시를 밀봉하고 1 시간 동안 실온에서 배양.
그 후, 검출 항체 용액을 버리고 세척 버퍼로 플레이트를 6번 세척합니다. 블로킹 버퍼에서 1~5, 000의 희석에 이차 염소 안티래빗 항체 HRP의 25 밀리리터를 준비한다. 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 이차 항체 용액 100마이크로리터를 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
이 인큐베이션이 끝나기 30분 전에, 부드러운 조명 조건에서 앰버 병에 루미놀 인핸서와 과산화수소 용액의 동일한 부분을 혼합합니다. 이 혼합물을 실온에 둡니다. 1시간 배양이 완료되면 이차 항체 용액을 버리고 세척 버퍼로 플레이트를 6번 세척합니다.
다음으로, 플레이트의 각 웰에 루미놀 작동 용액의 파이프 100 마이크로리터, 거품 형성을 피하기 위해 매우 느리게 파이프를 해야합니다. 타이머를 사용하여 용액의 첨가와 플레이트의 발광 측정 사이의 시간을 제어하고 좋은 상호 분석 형 재현성을 달성하기 위해이 시간을 일정하게 유지합니다. 상단은 접착제 필름과 원심분리기로 플레이트를 500배 G와 실온에서 45초 동안 밀봉하여 남은 거품을 제거합니다.
플레이트 셰이커에 플레이트를 100rpm에 1분간 배양합니다. 그런 다음 접착제 필름을 제거하고 마이크로 플레이트 판독기에 플레이트를 삽입하여 섭씨 25도에서 온도를 안정화하기 위해 3 분 동안 둡니다. 각 ELISA 플레이트 분석기의 상대발광 단위를 읽어보십시오.
추가 분석을 위해 원시 데이터 스프레드시트 파일에서 원시 RLU 값을 저장하고 복사합니다. 이 연구에서는, 새로운 KDM1A 화학 프로브 포획 기반 ELISA는 세포 및 조직 샘플에서 KDM1A 표적 참여를 직접 측정하는 데 사용됩니다. 총 RKDM1A의 RLU 값은 선형성을 확인하기 위해 평가됩니다.
3명의 독립적인 지원자로부터 인간 PBMC에서 감지된 총 및 무료 KDM1A의 RLU 값이 표준 곡선에 중첩됩니다. AML 세포는 공급자 권고에 따라 배양되고 다른 농도에서 차량 또는 ORY-1001로 처리됩니다. 네이티브 단백질 추출물은 25밀리몰러 OG-881 화학 프로브와 0.5 마이크로그램의 총 단백질이 표적 참여의 분석을 수행하는 데 사용된다.
그런 다음 총 KDM1A가 결정되고 ORY-1001에서 KDM1A에 대한 목표 참여비율이 차량에 비해 계산됩니다. 용량 반응형 KDM1A 표적 참여는 PBMC와 ORY-1001을 가진 쥐의 폐 처리에서 경구 개비에 의한, 계산된 상대적인 차량 그룹이 여기에 도시된다. 전 생체 내 비보 인큐베이션은 차량 치료 동물로부터 25 나노몰러 ORY-1001의 폐 단백질 추출물을 함유하고, 아직 전체 TE를 산출하지만, 킬로그램 ORY-1001당 30 마이크로그램으로 4일 동안 치료된 쥐의 샘플에서 TE를 더 이상 증가시키지 못하고, KDM1A가 이미 생체 내에서 완전히 억제되었다는 것을 확인하였다.
이 프로토콜은 KDM1A 대상 참여를 무료로 측정하여 KDM1A 대상 참여를 평가합니다. 그것은 네이티브 단백질 추출을 필요로 기억. 이 기술은 특정 억제제를 평가하기 위해 다른 종의 샘플에 사용할 수 있으며 새로운 억제제를 검사할 수도 있습니다.
이 연구에서 사용되는 화학 프로브는 또한 KDM1A 상호 작용을 연구하기 위해 화학 요법을 신청할 수 있습니다. KDM1A 억제제와 같은 생물학적 샘플 및 생리 활성 화합물을 취급할 때 항상 안전하고 존중해야 합니다.
