Hedef katılımın değerlendirilmesi, yani bir ilacın tasarladığı proteinle etkileşimi, ilaç geliştirmede veya temel araştırma projelerinde herhangi bir bileşiğin biyolojik aktivitesinin yorumlanması için temel bir gerekliliktir. Bu tekniğin en büyük avantajı, histon işaretleri ve ekspresyonu gibi downstream etkilerinin ölçümleri yerine, doz etkisinin ve KDM1A hedef etkileşiminin dinamiklerinin doğrudan ölçülmeye izin vermedir. Bu teknik temel araştırmalarda ve klinik çalışmalarda, farmakodinamik çalışması için KDM1A inhibitörü ile tedaviye tabi onkolojik CNS veya diğer hastalıklarda da uygulanabilir.
Bu teknik, ORY-1001, iadademstat çalışmak için geliştirilen bir kemoprob dayanmaktadır, ancak gerçekten diğer KDM1A inhibitörleri için kullanılabilir ve strateji diğer hedeflere uygulanabilir. Prosedür Raquel Ruiz, pk / PD keşif platformu benim laboratuvar operasyon yöneticisi tarafından gösterilecek. ORY-1001 ile hücre tedavisi sırasında bileşik çekirdekmevcut KDM1A protein bağlanır.
Bu prosedürü başlatmak için, buzdolabından 20 milimolar biyotinylated prob OG-881 stok çözeltisi 10 mikrolitre tek kullanımlık aliquot almak ve 10 dakika oda sıcaklığında ısınmaya bırakın. Filtre uçları ile bir micropipet kullanarak, seri iki mikromolar çalışma çözümü hazırlamak için stok çözeltisi seyreltmek. Daha sonra, bir mikrosantrifüj tüpppüşafat bir mililitre proteaz inhibitörü tabletini çözün.
Kemoprob ile istenilen 1x hücre lisis tamponunun istenilen hacminin her mililitresi için, elde edilen 100 mikrolitre ticari 10x hücre lisis tamponu, 10x proteaz inhibitörü150 mikrolitre, iki mikromolar OG-881 çalışma çözeltisinin 12,5 mikrolitresi ve 737,5 mikrolitre tip-1 çift distile su karıştırın. Hücreler herhangi bir serbest KDM1A proteinine bağlanan kemoprob varlığında 1x lysis tamponu içinde lysed edilir. Dokulardan hazırlanmak için, dondurulmuş doku bir santimetrekküp parçası pulverize ve homojenize kuru buz üzerinde soğutulmuş bir harç ve havaneli kullanın.
Aliquot tek kullanımlık şişeler içine doku, her şişe içine doku tozu yaklaşık 40 miligram aktarmak için emin olun, her zaman erime kaçınarak. Numuneleri işleme hazır olana kadar 80 derecede saklayın. Hücre peletlerinden hazırlanmak için, 25 nanomolar OG-881 içeren 1x hücreli lis tamponunun 200 mikrolitresinde yaklaşık 10 milyon hücrenin peletini yeniden askıya alın.
Girdap her örnek kısaca ve beş dakika buz üzerinde tutun. Bir sonicator kullanarak, her biri 20 saniye süren 45 kilohertz üç darbeler ile örnekleri sonicate. Darbeler arasında 20 saniye boyunca buz üzerinde örnekleri yerleştirin.
Örnekleri beş dakika daha buzda tutun. Daha sonra, girdap kısa bir süre ve 14, 000 kez G dört derece önceden soğutulmuş bir santrifüj 10 dakika için örnekleri santrifüj. Ayrı bir 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp içine her supernatant bir mililitre mikropipet transferi kullanarak.
İşlemeden önce tüpleri iki saat buzüzerinde bırakın. Daha sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi Bradford testini kullanarak yerli proteini ölçün. Toplam plaka anti-KDM1A antikor ile kaplanır.
Serbest plaka streptavidin ile kaplanır. Hücre lisate sonra her iki plaka eklenir ve KDM1A kompleksi doğrudan veya kemoprob yoluyla yakalanır. Plakalar yıkanır ve anti-KDM1A algılama antikor ve horseradish peroksidaz ile birleştiğinde ikincil bir antikor ile inkübe edilir.
Son olarak, Parlak substrat eklenir ve sinyal oluşturulur. Toplam KDM1A ELISA için, PBS'de 10 mililitre KDM1A yakalama antikorını her plaka için mililitre başına iki mikrogramlık son konsantrasyona hazırlayın. Plakanın her kuyuya 100 mikrolitre aktarın.
Ücretsiz KDM1A ELISA için, pbs streptavidin 10 mililitre her plaka için mililitre başına 10 mikrogram konsantrasyon olarak hazırlayın. Plakanın her kuyuya 100 mikrolitre aktarın. Daha sonra, yapıştırıcı film ile her plaka üst mühür ve dört derece santigrat gecede kuluçka.
Ertesi gün, buzdolabından tabakları çıkarın ve yaklaşık 45 dakika oda sıcaklığında dengesağlar. Her plakayı yıkama tamponuyla üç kez yıkayın, her yıkama adımından sonra plakayı kağıt havlulara değdirerek artık çözümü çıkarın. Her iki plakanın her kuyusu için engelleme tampon 200 mikrolitre ekleyin.
Üst yapışkan film ile plakaları mühür ve iki saat boyunca oda sıcaklığında kuluçka. Bu arada, uygun konsantrasyonp PBS ile daha önce elde edilen yerli protein özleri seyreltmek ve metin protokolünde belirtildiği gibi insan rKDM1A kullanarak standart bir eğri hazırlamak için plaka ortaya koyun. İki saatlik kuluçka süresi tamamlandıktan sonra, engelleme tamponunu atın ve plakaları yıkama tamponuyla yıkayın, her yıkama adımından sonra plakayı kağıt havluların üzerine dokunarak artık çözümü çıkarın.
Metin protokolünün ikinci tablosunda bulunan plaka dağılımını takiben uygun seyreltilmiş numuneleri buzdolabında 96 derin kuyu depolama bloğuna aktarın. Metin protokolünün üçüncü tablosunda bulunan plaka dağılımını takiben, her biri 100 mikrolitreyi toplam ve serbest ELISA plakalarına pipetleme sırasında bu bloğu buz üzerinde tutun. Bir saat boyunca oda sıcaklığında kuluçka, sonra örnekleri atın ve yıkama tampon ile beş kez plakaları yıkayın.
Mililitre başına 0,125 mikrogram konsantrasyonda tamponu bloke ederek 20 mililitre tavşan anti-KDM1A algılama antikorhazırlayın. Negatif kontrollere karşılık gelenler hariç, her iki plakanın her bir kuyusuna 100 mikrolitre algılama antikor çözeltisi ekleyin. Üst yapışkan film ile plakaları mühür ve bir saat oda sıcaklığında kuluçka.
Bundan sonra, algılama antikor çözeltisi atın ve yıkama tampon ile altı kez plakaları yıkayın. İkincil keçi anti-tavşan antikor, HRP, bir 5, 000 engelleme tampon bir seyreltme için 25 mililitre hazırlayın. Mikrotiter plakaların her kuyusuna ikincil antikor çözeltisinin 100 mikrolitresini ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın.
Bu kuluçka süresinin bitiminden 30 dakika önce, yumuşak ışık koşullarında kehribar şişesinde eşit miktarda luminol arttırıcı ve peroksit çözeltisini karıştırın. Bu karışımı oda sıcaklığında bırakın. Bir saatlik kuluçka tamamlandığında, ikincil antikor çözeltisini atın ve plakaları yıkama tamponuyla altı kez yıkayın.
Daha sonra, pipet 100 luminol çalışma çözeltisi plakaların her bir kuyuiçin, kabarcık oluşumunu önlemek için çok yavaş pipet emin olun. Çözeltinin eklenmesi ile plakaların parlaklık ölçümü arasındaki süreyi kontrol etmek için bir zamanlayıcı kullanın ve iyi bir karşılıklı tekrarlanabilirlik elde etmek için bu zamanı sabit tutun. Kalan kabarcıkları ortadan kaldırmak için 500 kez G ve oda sıcaklığında 45 saniye boyunca yapışkan film ve santrifüj ile plakaları üst mühür.
Bir dakika için 100 rpm bir plaka shaker plakaları kuluçka. Daha sonra yapışkan filmi çıkarın ve plakayı bir mikroplaka okuyucuya takın ve sıcaklığı 25 santigrat derecede sabitlemek için üç dakika bekletin. Her ELISA plaka titreşinin göreli parlaklık ünitelerini okuyun.
Daha fazla analiz için ham RLU değerlerini ham veri elektronik tablosu dosyalarından kaydedin ve kopyalayın. Bu çalışmada, yeni bir KDM1A kemoprob yakalama tabanlı ELISA doğrudan hücre ve doku örneklerinde KDM1A hedef nişan ölçmek için kullanılır. Toplam ve serbest rKDM1A'nın RLU değerleri doğrusallığı doğrulamak için değerlendirilir.
Üç bağımsız gönüllünün insan PBMC'lerinde tespit edilen toplam ve serbest KDM1A'nın RLU değerleri standart eğriye yerleştirilir. AML hücreleri sağlayıcı önerileri ne göre kültürlenir ve farklı konsantrasyonlarda araç veya ORY-1001 ile tedavi edilir. Yerli protein ekstresi 25 milimolar OG-881 kemoprob varlığında elde edilir ve toplam protein 0.5 mikrogram hedef nişan analizi gerçekleştirmek için kullanılır.
Daha sonra toplam ve ücretsiz KDM1A belirlenir ve ORY-1001'in KDM1A'ya hedef katılım yüzdeleri araca göre hesaplanır. PBMCs ve ORY-1001 oral gavaj ile sıçanların akciğer tedavisinde doz duyarlı KDM1A hedef nişan, hesaplanan göreceli araç grubu burada gösterilmiştir. Tedavi edilen araçlardan alınan 25 nanomolar ORY-1001 akciğer proteini özünün bulunduğu ex vivo kuluçka, tam TE verir, ancak dört gün boyunca tedavi edilen sıçanlardan alınan numunelerde kilogram ORY-1001 başına 30 mikrogram ile TE'yi daha da artırmaz ve KDM1A'nın invivo olarak tamamen inhibe edildiğini doğrular.
Bu protokol, kdm1A hedef katılımını ücretsiz ve toplam KDM1A ölçerek değerlendirir. Yerli protein ekstraksiyonu gerektirdiğini unutmayın. Bu teknik, belirli bir inhibitörü değerlendirmek için farklı türlerden örnekler de kullanılabilir, ayrıca yeni inhibitörleri taramak için.
Bu çalışmada kullanılan kemoprob da KDM1A etkileşimçalışması için kemoproteomics için uygulanabilir. KDM1A inhibitörü gibi biyolojik numuneleri ve biyoaktif bileşikleri kullanırken güvenli bir şekilde çalışmayı ve her zaman önleyici tedbirlere saygı göstermeyi unutmayın.
