L’évaluation de l’engagement cible, c’est-à-dire l’interaction d’un médicament avec la protéine pour qui il a été conçu, est une exigence fondamentale pour l’interprétation de l’activité biologique de tout composé dans le développement de médicaments, ou dans des projets de recherche fondamentale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de mesurer directement l’effet de dose et la dynamique de l’engagement cible KDM1A, plutôt que des mesures des effets en aval tels que les marques d’histone et l’expression. Cette technique peut être appliquée dans la recherche fondamentale et aussi dans les essais cliniques, dans le SNC oncologique ou d’autres maladies soumises à un traitement avec inhibiteur de KDM1A pour étudier la pharmacodynamique.
Cette technique est basée sur un chimioprobe développé pour étudier ORY-1001, iadademstat, mais peut être vraiment utilisé pour d’autres inhibiteurs KDM1A et la stratégie peut être appliquée à d’autres cibles. La procédure sera démontrée par Raquel Ruiz, directeur des opérations de la plate-forme de découverte PK/PD de mon laboratoire. Pendant le traitement cellulaire avec ORY-1001, le composé se lie à la protéine KDM1A présente dans le noyau.
Pour commencer cette procédure, récupérez un aliquot à usage unique de 10 microlitres de la sonde biotinylée OG-881 de 20 millimolaires dans le réfrigérateur et laissez-le chauffer à température ambiante pendant 10 minutes. À l’aide d’un micropipet avec des pointes de filtre, diluer en série la solution de stock pour préparer la solution de travail deux micromolaires. Ensuite, dissoudre un comprimé d’inhibiteur de la protéase dans un millilitre de PBS dans un tube de microcentrifugeuse.
Pour chaque millilitre du volume désiré de tampon de lyse de cellules 1x avec la chimioprobe, mélanger 100 microlitres de tampon de lyse de cellules 10x obtenus commercialement, 150 microlitres de l’inhibiteur de la protéase 10x, 12,5 microlitres des deux micromolaires OG-881 solution de travail et 737,5 microlitres d’eau distillée double de type 1. Les cellules sont lysées dans le tampon de lyse 1x en présence de la chimioprobe qui se lie à toute protéine KDM1A libre. Pour se préparer à partir de tissus, utilisez un mortier et un pilon qui sont refroidis sur la glace sèche pour pulvériser et homogénéiser un morceau cube de tissu congelé.
Aliquot le tissu en flacons à usage unique, en s’assurant de transférer environ 40 milligrammes de poudre de tissu dans chaque flacon, tout en évitant la décongélation en tout temps. Conserver les échantillons à 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être traiter. Pour se préparer à partir de granulés cellulaires, résuspendez la pastille d’environ 10 millions de cellules dans 200 microlitres de tampon de lyse cellulaire 1x contenant 25 nanomolaires OG-881.
Vortex chaque échantillon brièvement et les garder sur la glace pendant cinq minutes. À l’aide d’un sonicateur, sonifier les échantillons avec trois impulsions à 45 kilohertz d’une durée de 20 secondes chacune. Placez les échantillons sur la glace pendant 20 secondes entre les impulsions.
Gardez les échantillons sur la glace pendant cinq minutes supplémentaires. Puis, vortex brièvement et centrifugeuse les échantillons à 14 000 fois G pendant 10 minutes dans une centrifugeuse qui est pré-réfrigérée à quatre degrés Celsius. À l’aide d’un micropipet d’un millilitre, transférer chaque supernatant dans un tube de microcentrifugeuse séparé de 1,5 millilitre.
Laisser les tubes sur la glace pendant deux heures avant le traitement. Ensuite, quantifier la protéine indigène à l’aide de l’analyse bradford tel que décrit dans le protocole de texte. Une plaque totale est recouverte d’anticorps anti-KDM1A.
La plaque libre est recouverte de streptavidine. Le lysate cellulaire est ensuite ajouté aux plaques et le complexe KDM1A est capturé directement ou par la chimioprobe. Les plaques sont lavées et incubées avec l’anticorps de détection anti-KDM1A et un anticorps secondaire couplé à la peroxyde de raifort.
Enfin, le substrat luminescent est ajouté et le signal généré. Pour un total de KDM1A ELISA, préparez 10 millilitres d’anticorps de capture KDM1A dans PBS à une concentration finale de deux microgrammes par millilitre pour chaque plaque. Transférer 100 microlitres dans chaque puits de la plaque.
Pour kDM1A ELISA gratuit, préparez 10 millilitres de streptavidine dans PBS comme une concentration de 10 microgrammes par millilitre pour chaque plaque. Transférer 100 microlitres dans chaque puits de la plaque. Ensuite, sceller chaque plaque avec un film adhésif et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius.
Le lendemain, retirer les assiettes du réfrigérateur et laisser les équilibrer à température ambiante pendant environ 45 minutes. Lavez chaque assiette trois fois avec un tampon de lavage, en vous assurant de taper la plaque sur du papier absorbant après chaque étape de lavage pour enlever toute solution résiduelle. Ajouter 200 microlitres de tampon de blocage à chaque puits des deux plaques.
Sceller les plaques avec du film adhésif et incuber à température ambiante pendant deux heures. Pendant ce temps, diluer les extraits de protéines indigènes précédemment obtenus avec PBS à la concentration appropriée et exposer la plaque pour préparer une courbe standard en utilisant rKDM1A humain tel que décrit dans le protocole de texte. Après l’incubation de deux heures est terminée, jeter le tampon de blocage et laver les plaques avec tampon de lavage, en s’assurant de taper la plaque sur des serviettes en papier après chaque étape de lavage pour enlever toute solution résiduelle.
Transférez les échantillons dilués appropriés dans un bloc d’entreposage réfrigéré de 96 puits profonds suivant la distribution des plaques trouvée dans le tableau deux du protocole textuel. Gardez ce bloc sur la glace tout en pipetting 100 microlitres par puits dans le total et libre plaques ELISA suivant la distribution des plaques trouvées dans le tableau trois du protocole de texte. Incuber à température ambiante pendant une heure, puis jeter les échantillons et laver les assiettes cinq fois avec un tampon de lavage.
Préparez 20 millilitres d’anticorps de détection anti-KDM1A de lapin en bloquant le tampon à une concentration de 0,125 microgramme par millilitre. Ajouter 100 microlitres de la solution d’anticorps de détection à chaque puits des deux plaques, à l’exception de ceux correspondant aux contrôles négatifs. Sceller les assiettes avec du film adhésif et incuber à température ambiante pendant une heure.
Après cela, jetez la solution d’anticorps de détection et lavez les plaques six fois avec le tampon de lavage. Préparez 25 millilitres d’anticorps secondaire anti-lapin de chèvre, HRP, à une dilution de 1 à 5000 dans le tampon bloquant. Ajouter 100 microlitres de la solution d’anticorps secondaire à chaque puits des plaques de microtiter et incuber à température ambiante pendant une heure.
30 minutes avant la fin de cette incubation, mélanger des parties égales d’exhausteur de luminol et de solution de peroxyde dans une bouteille d’ambre dans des conditions de lumière douce. Laissez ce mélange à température ambiante. Lorsque l’incubation d’une heure est terminée, jetez la solution d’anticorps secondaire et lavez les assiettes six fois avec un tampon de lavage.
Ensuite, pipet 100 microlitres de la solution de travail luminol à chaque puits des plaques, en s’assurant de pipet très lentement pour éviter la formation de bulles. Utilisez une interminable pour contrôler le temps entre l’ajout de la solution et la mesure de luminescence des plaques et garder ce temps constant pour obtenir une bonne reproductibilité inter-analyse. Sceller les plaques avec un film adhésif et une centrifugeuse à 500 fois G et à température ambiante pendant 45 secondes pour éliminer les bulles restantes.
Incuber les assiettes sur un shaker à 100 rpm pendant une minute. Ensuite, retirez le film adhésif et insérez la plaque dans un lecteur de microplaque et laissez-la pendant trois minutes pour stabiliser la température à 25 degrés Celsius. Lisez les unités de luminescence relative de chaque analyse de plaque ELISA.
Enregistrez et copiez les valeurs RLU brutes à partir des fichiers de feuilles de calcul de données brutes pour une analyse plus approfondie. Dans cette étude, une nouvelle ELISA basée sur la capture de chimioprobe KDM1A est utilisée pour mesurer directement l’engagement cible de KDM1A dans les cellules et les échantillons de tissus. Les valeurs RLU de rKDM1A total et gratuit sont évaluées pour vérifier la linéarité.
Les valeurs RLU de KDM1A total et libre détectées chez les PBMCs humains de trois volontaires indépendants sont ensuite superposées à la courbe standard. Les cellules de la LAM sont cultivés selon les recommandations du fournisseur et sont traitées avec un véhicule ou un ORY-1001 à différentes concentrations. L’extrait de protéine indigène sont obtenus en présence de 25 millimolaires OG-881 chemoprobe et 0,5 microgramme de protéines totales est utilisé pour effectuer l’analyse de l’engagement cible.
Le KDM1A total et gratuit est alors déterminé et les pourcentages d’engagement cible d’ORY-1001 à KDM1A sont calculés par rapport au véhicule. L’engagement cible KDM1A dose-sensible dans les PBMCs et dans le traitement de poumon des rats avec ORY-1001 par gavage oral, parent calculé le groupe de véhicule est montré ici. L’incubation ex vivo avec 25 nanomolaires ORY-1001 d’extraits de protéines pulmonaires du véhicule traités animaux, donne te complet, encore, mais n’augmente pas davantage TE dans les échantillons de rats traités pendant quatre jours avec 30 microgrammes par kilogramme ORY-1001, confirmant KDM1A était déjà entièrement inhibé in vivo.
Ce protocole évalue l’engagement cible de KDM1A en mesurant la KDM1A gratuite et totale. Rappelez-vous qu’il nécessite l’extraction de protéines indigènes. Cette technique peut être utilisée sur des échantillons de différentes espèces pour évaluer un inhibiteur spécifique, également pour dépister de nouveaux inhibiteurs.
La chimioprobe utilisée dans cette étude peut également être appliquée à la chimioprotéomique pour étudier l’interactum KDM1A. N’oubliez pas de travailler en toute sécurité et de respecter en tout temps les mesures préventives lors de la manipulation d’échantillons biologiques et de composés bioactifs comme l’inhibiteur du KDM1A.
