Оценка целевого взаимодействия, то есть взаимодействия препарата с белком, для которого он был разработан, является основным требованием для интерпретации биологической активности любого соединения в разработке лекарственных препаратов или в проектах фундаментальных исследований. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет прямо измерять эффект дозы и динамику целевого взаимодействия KDM1A, а не измерения эффектов ниже по течению, таких как следы и экспрессия гистона. Этот метод может быть применен в фундаментальных исследованиях, а также в клинических испытаниях, в онкологических ЦНС или других заболеваний, подлежащих лечению ингибитором KDM1A для изучения фармакодинамики.
Этот метод основан на хемопробе, разработанном для изучения ORY-1001, iadademstat, но может быть действительно использован для других ингибиторов KDM1A и стратегия может быть применена к другим целям. Процедура будет продемонстрирована Ракель Руис, менеджер по эксплуатации платформы обнаружения PK/PD из моей лаборатории. Во время клеточной обработки ORY-1001 соединение связывается с белком KDM1A, присутствующим в ядре.
Чтобы начать эту процедуру, получить 10 микролитр одноразовый aliquot 20 миллимолярный биотинилированный зонд OG-881 фондовый раствор из холодильника и дайте ему прогреться при комнатной температуре в течение 10 минут. Используя микропайп с фильтром советы, последовательно разбавить фондовый раствор для подготовки двух микромоляных рабочих решений. Затем растворите одну таблетку ингибитора протеазы в одном миллилитре PBS в микроцентрифугной трубке.
Для каждого миллилитра желаемого объема буфера лизиса 1x клеток с хемопробом смешайте 100 микролитров коммерческих полученных 10x буфера лизиса клеток, 150 микролитров ингибитора протеазы 10x, 12,5 микролитров двух микромоляных OG-881 рабочего раствора и 737,5 микролитров двойной дистилляции воды типа-1. Клетки лизированы в буфере лизиса 1x в присутствии хемопроба, который связывается с любым свободным белком KDM1A. Чтобы подготовиться из тканей, используйте раствор и пестик, которые охлаждаются на сухом льду, чтобы распылить и гомогенизировать один кубический сантиметр кусок замороженных тканей.
Aliquot ткани в одноразовые флаконы, убедившись, что для передачи около 40 миллиграммов порошка ткани в каждый флакон, избегая при этом оттаивания во все времена. Храните образцы при 80 градусах цельсия до готовности к обработке. Чтобы подготовиться к клеточным гранулам, повторно наполнив гранулы примерно 10 миллионов клеток в 200 микролитров буфера лиза 1x клеток, содержащего 25 наномолярных OG-881.
Vortex каждый образец кратко и держать их на льду в течение пяти минут. Используя звуковой, sonicate образцы с тремя импульсами на 45 килогерц продолжительностью 20 секунд каждый. Поместите образцы на лед в течение 20 секунд между импульсами.
Храните образцы на льду еще пять минут. Затем вихрь кратко и центрифуга образцов на 14000 раз G в течение 10 минут в центрифуге, которая предварительно охлаждается при четырех градусах по Цельсию. С помощью одного миллилитров микропайпера перенесите каждый супернатант в отдельную микроцентрифугную трубку на 1,5 миллилитров.
Оставьте трубки на льду на два часа перед обработкой. Затем, количественно родной белок с помощью Bradford анализ, как указано в текстовом протоколе. Общая пластина покрыта антителами против КДМ1А.
Бесплатная тарелка покрыта стрептавидином. Сотовый лизат затем добавляется к обеим пластинам и KDM1A комплекс захвачен непосредственно или через chemoprobe. Пластины промывают и инкубируется анти-KDM1A обнаружения антител и вторичного антитела в сочетании с пероксидазом хрена.
Наконец, добавляется люминесцентный субстрат и генерируется сигнал. Для общей KDM1A ELISA, подготовить 10 миллилитров KDM1A захвата антитела в PBS к окончательной концентрации двух микрограмм на миллилитр для каждой пластины. Перенесите 100 микролитров в каждый колодец пластины.
Бесплатно KDM1A ELISA, подготовить 10 миллилитров стрептавидина в PBS в концентрации 10 микрограмм на миллилитр для каждой пластины. Перенесите 100 микролитров в каждый колодец пластины. Затем, верхняя печать каждой пластины с клейкой пленкой и инкубировать на ночь при четырех градусах по Цельсию.
На следующий день, удалить пластины из холодильника и пусть они равноденствия при комнатной температуре в течение примерно 45 минут. Вымойте каждую тарелку три раза с помощью буфера для мытья, убедившись, что нажмите пластину на бумажные полотенца после каждого шага стирки, чтобы удалить любой остаточный раствор. Добавьте 200 микролитров блокирующего буфера к каждой пластине обеих пластин.
Сверху запечатывают пластины клейкой пленкой и инкубируют при комнатной температуре в течение двух часов. Между тем, разбавить ранее полученные местные экстракты белка с PBS к соответствующей концентрации и выложить пластину для подготовки стандартной кривой с использованием человека rKDM1A, как указано в текстовом протоколе. После двухчасовой инкубации завершена, отбросить блокирующий буфер и мыть пластины с буфером мытья, убедившись, что нажмите пластину на бумажные полотенца после каждого шага стирки, чтобы удалить любой остаточный раствор.
Перенесите соответствующие разбавленные образцы в охлажденный блок хранения 96 глубоких колодец после распределения пластин, найденных в таблице 2 текстового протокола. Держите этот блок на льду в то время как трубопроводы 100 микролитров на колодец в общей и свободной пластины ELISA после распределения пластины найти в таблице три текста протокола. Инкубировать при комнатной температуре в течение одного часа, затем отказаться от образцов и мыть пластины пять раз с мыть буфера.
Подготовка 20 миллилитров кролика анти-KDM1A обнаружения антител в блокировании буфера в концентрации 0,125 микрограмм на миллилитр. Добавьте 100 микролитров раствора антител обнаружения к каждой пластине обеих пластин, за исключением тех, которые соответствующи отрицательному контролю. Сверху запечатывают пластины клейкой пленкой и инкубируют при комнатной температуре в течение одного часа.
После этого отбросьте раствор антител обнаружения и промыть пластины шесть раз буфером для мытья. Подготовь 25 миллилитров вторичного козьего антиколичного антитела, HRP, к разбавлению от одного до 5 000 в блокирующий буфер. Добавьте 100 микролитров вторичного раствора антител к каждой пластине микротитров и инкубировать при комнатной температуре в течение одного часа.
За 30 минут до окончания этой инкубации смешайте равные части усилителя люминола и раствор перекиси в янтарной бутылке в условиях мягкого освещения. Оставьте эту смесь при комнатной температуре. Когда один час инкубации завершена, отказаться от вторичного раствора антитела и мыть пластины шесть раз с мыть буфера.
Далее, пипетки 100 микролитров люминола рабочий раствор для каждой колодец пластин, убедившись, что труба очень медленно, чтобы избежать образования пузыря. Используйте таймер, чтобы контролировать время между добавлением раствора и измерением люминесценции пластин и держать это время постоянным для достижения хорошей воспроизводимости между анализами. Топ уплотнения пластин с клейкой пленкой и центрифугой в 500 раз G и при комнатной температуре в течение 45 секунд, чтобы устранить все оставшиеся пузырьки.
Инкубировать тарелки на тарелке шейкер при 100 об/мин в течение одной минуты. Затем снимите клейкую пленку и вставьте пластину в считыватель микроплатформ и оставьте ее на три минуты, чтобы стабилизировать температуру при температуре 25 градусов по Цельсию. Прочитайте относительные единицы люминесценции каждого анализа пластины ELISA.
Сохранить и скопировать необработанные значения RLU из необработанных файлов электронной таблицы данных для дальнейшего анализа. В этом исследовании, новый KDM1A хемопроб захвата на основе ELISA используется для непосредственного измерения KDM1A целевого взаимодействия в клетках и образцах тканей. Значения RLU общего и бесплатного rKDM1A оцениваются для проверки линейности.
Значения RLU общего и бесплатного KDM1A, обнаруженные в человеческих ПКМК от трех независимых добровольцев, затем накладываются на стандартную кривую. Ячейки AML культуриются в соответствии с рекомендациями поставщика и обрабатываются либо транспортным средством, либо ORY-1001 в различных концентрациях. Экстракт родного белка получен в присутствии 25 миллимоляров ОГ-881 хемопроб и 0,5 микрограмма общего белка используется для выполнения анализа целевого взаимодействия.
Затем определяются общие и бесплатные KDM1A, и процент целевого участия ORY-1001 в KDM1A рассчитывается по отношению к транспортному средству. Доза-реакции KDM1A целевого участия в ПХМС и в легких лечения крыс с ORY-1001 устные gavage, рассчитывается относительно группы транспортных средств показано здесь. Ex vivo инкубации с 25 наномолярных ORY-1001 экстрактов белка легких из транспортного средства лечение животных, дает полный TE, но не дальнейшее увеличение TE в образцах от крыс, обработанных в течение четырех дней с 30 микрограммов на килограмм ORY-1001, подтверждающие KDM1A уже полностью ингибируется in vivo.
В этом протоколе оценивается целевое взаимодействие KDM1A путем измерения свободного и полного KDM1A. Помните, что это требует экстракции родного белка. Этот метод может быть использован на образцах различных видов для оценки конкретного ингибитора, а также для проверки на новые ингибиторы.
Хемопроб, используемый в этом исследовании, также может быть применен для химиопротемии для изучения взаимодействия KDM1A. Не забудьте работать безопасно и уважать во все времена профилактические меры при обработке биологических образцов и биологически активных соединений, таких как ингибитор KDM1A.
