פרוטוקול זה מתאר את הסינתזה של מערכת חלקיקים כי הוא מסוגל להשתיק גנים ב vivo על ידי אספקת siRNAs ביעילות גבוהה. פשוט על ידי החלפת פפטיד מיקוד מטען siRNA, חלקיקים fusogenic עשוי לשמש ניסוח טיפולי פוטנציאלי למחלות הדורשות אפנון גנים vivo. פרסמנו בעבר תוצאות באמצעות nanoplatform fusogenic נגד זיהומים חיידקיים גרם חיובי על ידי השתקה גן המקודד דלקת מקרופאגים לסיים דלקת כרונית.
לפני ביצוע הליך זה, להרכיב תא תחריט טפלון המכיל רקיק סיליקון בתתבר חומצה הידרופלואורית 3 ל-1. הפעל זרם לסירוגין של צורת גל מרובעת עם צפיפות זרם נמוכה של 50 מיליאמפר לס"מ בריבוע למשך 0.6 שניות וצפיפות זרם גבוהה של 400 מיליאמפר לס"מ בריבוע למשך 0.36 שניות חוזרות על עצמן במשך 500 מחזורים. לאחר סיום התחריט, הסר את התא מהמעגל, ושטוף בזהירות את תותב החומצה ההידרופלואורית באמצעות מזרק.
לאחר מכן, לשטוף שלוש פעמים עם אתנול. כדי להרים את השכבה הנקבובית מוופל הסיליקון, מלא תחילה את הבאר של תא התחריט ב-10 מיליליטר של תוסף חומצה הידרופלואורית של אחד ל-29. לאחר מכן, לרוץ קבוע של 3.7 מיליאמפר אחוזים בריבוע במשך 250 שניות.
לאחר תחריט הוא סיים, להסיר את התא מהמעגל. לשכבת הסיליקון הנקבובית עשויים להיות אדוות נראות לעין, מה שמצביע על ניתוק מוופל הסיליקון הגבישי. לשטוף בעדינות את תספור החומצה ההידרופלואורית, ולשטוף שלוש פעמים כל אחד עם אתנול ומים.
בעזרת קצה פיפטה, סדקו בחוזקה את היקף שכבת הסיליקון הנקבובית לניתוק מוחלט. באמצעות אתנול, לאסוף את שברי סיליקון נקבובי, או שבבים, מתא תחריט טפלון לתוך סירה במשקל. לאחר מכן, להעביר את השבבים לבקבוקון זכוכית לאחסון.
לאחר מכן, החלף את האתנול בבקבוקון הזכוכית המכיל את שבבי הסיליקון הנקבוביים בשני מיליליטר של מים נטולי RNase. כובע בחוזקה ולאטום את הבקבוקון באמצעות Parafilm. מניחים את בקבוקון הזכוכית באמבטיה sonicator מושעה כך נפח שבבי סיליקון נקבובי שקועים לחלוטין מתחת לפני השטח של אמבט המים.
כדי למנוע אובדן מים משמעותי במהלך sonication, מניחים בקבוק נפח מלא מים, הפוך כך פתיחת הבקבוק נוגע על פני השטח של אמבט המים. לאחר מכן, sonicate שבבי סיליקון נקבובי במשך 12 שעות ב 35 קילוהרץ עם כוח RF של 48 וואט. לאחר sonication, מניחים את בקבוקון הזכוכית על משטח שטוח במשך שעה אחת כדי לאפשר לחלקיקים הגדולים להתיישב בתחתית.
לאחר מכן, לאסוף את supernatant באמצעות פיפטה. בבקבוקון זכוכית, הוסיפו 72.55 מיקרוליטרים של פתרון DMPC, 15.16 מיקרוליטרים של פתרון DSPE-PEG ו-19.63 מיקרוליטרים של פתרון DOTAP, וערבבו לפי צינורות. מניחים את הבקבוקון במכסה המנוע של אדים עם כובע רופף כדי לאפשר לממס להתאדות בן לילה.
הסרט המיובש יהיה חומר מעונן, קשה, דמוי ג'ל בתחתית הבקבוקון. לאחר מכן, מניחים צינור מיקרוצנטריפוגה המכיל 150 מיקרוליטרים של חלקיקי סיליקון נקבוביים באמבט sonication קר שהוכן בעבר. תחת ultrasonication 15 דקות, בעדינות pipette 150 microliters של siRNA ו 700 microliters של שני טוחנת סידן כלורי לתוך חלקיקי סיליקון נקבובי.
הסר את הצינור המכיל מיליליטר אחד של חלקיקי סיליקון נקבוביים מצופים סידן מצופים siRNA מהסוניקטור. ממלאים מקור רחב במים מיונים. משרים קרום פוליקרבונט וארבעה תומכים במסנן על ידי הצפתם על פני המים.
לאחר מכן, להרכיב ערכת שולט ליפוזום על ידי ביצוע הוראות היצרן. לאחר מכן, לחות את הסרט השומנים מיובשים בקבוקון זכוכית עם מיליליטר אחד של חלקיקי סיליקון נקבובי מצופה סידן טעון siRNA. פיפטה עד שכל השומנים הוסרו מתחתית הבקבוקון ופתרון מעונן והומוגני נצפה.
מוסיפים בר ערבוב מגנטי לבקבוקון הזכוכית, ומ מניחים את הבקבוקון על צלחת חמה כדי לחמם את החלקיקים ל -40 מעלות צלזיוס תוך ערבוב מגנטי של הפתרון במשך 20 דקות. לאחר מכן, לצרף מזרק ריק לצד אחד של extruder. לאחר מכן, למלא מזרק אחר עם מיליליטר אחד של פתרון ננו חלקיקי סיליקון נקבובי מצופה השומנים, ולצרף את המזרק לצד השני של extruder.
התחל את ההבלטה על ידי דחיפת הבוכנה לאט לדחוף את החלקיקים ממזרק אחד, דרך קרום פוליקרבונט, ולתוך המזרק השני. חזור על הפעולה 20 פעמים. לאחר מכן, לאסוף את החלקיקים המובלטים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה.
הכינו מלאי פפטיד עם ריכוז פפטיד של מיליגרם למיליליטר במים נטולי RNase. בצינור microcentrifuge המכיל את חלקיקי סיליקון נקבובי מצופה שומנים fusogenicic, להוסיף 100 microliters של מלאי פפטיד, ו pipette בעדינות. שמור על הצינור סטטי בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
כדי להסיר עודף פפטיד או siRNA ו excipients אחרים, לשטוף מסנן צנטריפוגלי 30 קילודלטון על ידי ספינינג ב 5, 000 פעמים גרם בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. צנטריפוגה פעמיים נוספות עם מיליליטר אחד של PBS תחת אותן הגדרות. לאחר הצנטריפוגה, יש להתחדש בננו-חלקיקי הסיליקון הנקבוביים הסופיים מצופים הפוטידים ב-PBS בריכוז הרצוי.
החלקיקים יכולים להיות aliquoted ומאוחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס לפחות 30 ימים. סינתזה מוצלחת של חלקיקי סיליקון נקבובי fusogenicics צריך לייצר פתרון הומוגני, אטום מעט כי ניתן לאחסן במשך 30 ימים מופשר מבלי לגרום לשינויים מבניים. אי אופטימיזציה של היחס והריכוז, כמו גם מחזורי הפשרה חוזרים ונשנים עלולים להוביל לצבירה בעת הטעינה.
כאשר החלקיקים מובלטים, הקוטר ההידרודינמי הממוצע של חלקיקי הסיליקון הנקבוביים הפוסוגניים הנמדדים על ידי פיזור אור דינמי צריך להיות כ -200 ננומטר ופוטנציאל הזטה הממוצע בערך חיובי שבעה מילי-וולט. לאחר שינוי פני השטח עם פפטידים מיקוד, הקוטר הכולל צריך להיות פחות מ 230 ננומטר, ואת זטה הפוטנציאל הממוצע יורד למינוס 3.4 מיליבולטים. היתוך עשוי להיות מאושר על ידי תיוג שומנים fusogenic עם פלואורופור DiI ליפופילי והתבוננות לוקליזציה במבחנה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
היתוך מוצלח נצפה כאשר השומנים של סיליקון נקבובי fusogenicic להעביר את DiI לתוך קרום הפלזמה והם מקומיים ללא תלות lysosomes. היתוך לא מוצלח יראה את לוקליזציה DiI בתוך הציטופלסמה של התא ולוקליזציה שיתוף עם lysosomes. מערכת חלקיקים fusogenic זה משמש כעת עבור יישומים טיפוליים לא רק זיהומים חיידקיים, אלא גם בטיפול גוף סרטני אימונותרפיה סרטן.
פרוטוקול זה עשוי להיות ממוטב עוד יותר כדי לטעון יותר מאשר siRNAs. מערכת הננו-חלקיקים הפוגנית הראתה פוטנציאל בטעינה ואספקה של מטענים אניונים גדולים יותר, כגון mRNAs ומתסביכים CRISPR/Cas9.
