يصف هذا البروتوكول تركيب نظام الجسيمات النانوية القادر على إسكات الجينات في الجسم الحي عن طريق تقديم الـ siRNAs بكفاءة عالية. بمجرد تبادل الببتيد المستهدف وحمولة الـ siRNA ، يمكن استخدام الجسيمات النانوية الفوسوجينية كصياح علاجي محتمل للأمراض التي تتطلب في تعديل الجينات الحية. لقد نشرنا النتائج سابقا باستخدام نانوفورم fusogenic ضد الالتهابات البكتيرية إيجابية الجرام عن طريق إسكات الجين الذي يشفّر لالتهاب في الضامة لإنهاء الالتهاب المزمن.
قبل تنفيذ هذا الإجراء، قم بتجميع خلية تفلون حفر تحتوي على رقاقة سيليكون في محلول حمض هيدروفلوريك ثلاثة إلى واحد. تشغيل تيار متناوب من شكل موجي مربع مع كثافة تيار منخفض من 50 مللي امبير في سنتيمتر مربع لمدة 0.6 ثانية وكثافة تيار عالية من 400 مللي امبير في سنتيمتر مربع لمدة 0.36 ثانية تتكرر لدورات 500. بمجرد الانتهاء من الحفر ، قم بإزالة الخلية من الدائرة ، وشطف محلول حمض الهيدروفلوريك بعناية باستخدام حقنة.
ثم شطف ثلاث مرات مع الإيثانول. لرفع قبالة طبقة مسامية من رقاقة السيليكون، أولا ملء بئر الخلية حفر مع 10 ملليلتر من واحد إلى 29 محلول حمض الهيدروفلوريك. ثم، تشغيل ثابت من 3.7 مللي امبير في سنتيمتر مربع لمدة 250 ثانية.
بمجرد الانتهاء من الحفر ، وإزالة الخلية من الدائرة. قد يكون لطبقة السيليكون المسامية تموجات مرئية، مما يشير إلى انفصالها عن رقاقة السيليكون البلورية. غسل بلطف من محلول حمض الهيدروفلوريك، وشطف ثلاث مرات كل مع الإيثانول والماء.
باستخدام طرف ماصة، الكراك بحزم محيط طبقة السيليكون المسامية فصاعدة كاملة. باستخدام الإيثانول، وجمع شظايا السيليكون المسامية، أو رقائق، من خلية حفر تفلون في قارب وزنها. ثم، نقل رقائق إلى قارورة زجاجية للتخزين.
بعد ذلك، استبدل الإيثانول في القارورة الزجاجية التي تحتوي على رقائق السيليكون المسامية بمليلترين من المياه الخالية من RNase. سقف بحزم وختم القارورة باستخدام بارا فيلم. وضع الزجاج القارورة في حمام سونيكاتور وعلقت بحيث يتم غمر حجم رقائق السيليكون مسامية تماما تحت سطح حمام الماء.
لمنع فقدان المياه كبيرة أثناء سونيكيشن، وضع قارورة الحجمي مليئة بالماء، مقلوب بحيث يلامس فتح قارورة سطح حمام الماء. ثم، سونيكات رقائق السيليكون المسامية لمدة 12 ساعة في 35 كيلوهيرتز مع قوة الترددات اللاسلكية من 48 واط. بعد صوتنة، ضع قارورة الزجاج على سطح مستو لمدة ساعة واحدة للسماح للجسيمات الأكبر أن تستقر في القاع.
ثم، وجمع الماغن باستخدام ماصة. في قارورة الزجاج، إضافة 72.55 ميكرولترات من حل DMPC، 15.16 ميكرولتررز من حل DSPE-PEG، و 19.63 ميكرولترات من الحل DOTAP، ومزيج عن طريق الأنابيب. ضع القارورة في غطاء دخان مع غطاء فضفاض للسماح للمذيبات بالتبخر بين عشية وضحاها.
سيكون الفيلم المجفف مادة غائمة، صلبة، تشبه الهلام في الجزء السفلي من القارورة. المقبل، وضع أنبوب microcentrifuge تحتوي على 150 ميكرولترات من الجسيمات النانوية السيليكون مسامية في حمام سونيكيشن المثلج أعدت سابقا. تحت ultrasonication 15 دقيقة، ماص بلطف 150 ميكرولتر من الرنا و 700 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم اثنين من المولور في الجسيمات النانوية السيليكون المسامية.
إزالة أنبوب يحتوي على ملليلتر واحد من جسيمات نانوية السيليكون المسامية محملة بالكالسيوم من سونيكاتور. ملء بواكير واسعة مع المياه الأيونية. نقع غشاء البولي وأربعة مرشح يدعم عن طريق تعويم لهم على سطح الماء.
ثم، تجميع مجموعة بثق الدهون عن طريق اتباع تعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك، هيدرات فيلم الدهون المجففة في القارورة الزجاجية مع ملليلتر واحد من جسيمات السيليكون النانوية المسامية المحملة بالكالسيوم التي تحملها السيلنا. الماصات حتى يتم رفع جميع الدهون من الجزء السفلي من القارورة ويتم ملاحظة حل غائم ومتجانس.
إضافة شريط التحريك المغناطيسي إلى القارورة الزجاجية، ووضع القارورة على لوحة ساخنة لتسخين الجسيمات إلى 40 درجة مئوية في حين اثارة المغناطيسي الحل لمدة 20 دقيقة. بعد هذا، إرفاق حقنة فارغة إلى جانب واحد من الطارد. ثم، ملء حقنة أخرى مع ملليلتر واحد من محلول جسيمات السيليكون النانوية المسامية المغلفة بالدهون، وإرفاق الحقنة إلى الجانب الآخر من الطارد.
ابدأ البثق عن طريق دفع المكبس ببطء لدفع الجسيمات من حقنة واحدة ، من خلال الغشاء البولي ، وإلى الحقنة الأخرى. كرر 20 مرة. ثم، وجمع الجسيمات مقذوف في أنبوب microcentrifuge.
إعداد مخزون الببتيد مع تركيز ببتيد واحد ملليغرام لكل ملليلتر في المياه الخالية من RNase. في أنبوب microcentrifuge التي تحتوي على جسيمات نانوية السيليكون المسامية المغلفة بالدهون المكسوة بالدهونية، أضف 100 ميكرولترات من مخزون الببتيد، والماصات بلطف. الحفاظ على أنبوب ثابت في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
لإزالة الببتيد الزائد أو الرنا وغيرها من سواغ، يغسل في مرشح الطرد المركزي 30 كيلودالتون عن طريق الغزل في 5، 000 مرات ز في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. جهاز طرد مركزي مرتين مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني تحت نفس الإعدادات. بعد الطرد المركزي، resuspend النهائي الببتيد مترافق الدهون مترافق مسامية الدهون جسيمات نانوية مسامية في PBS في التركيز المطلوب.
ويمكن أن تكون الجزيئات aliquoted وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية لمدة 30 يوما على الأقل. وينبغي أن ينتج عن توليف ناجح للجسيمات النانوية السيليكونية المسامية المذابة حلًا متجانسًا مبهمًا بعض الشيء قد يتم تخزينه لمدة 30 يومًا وذوبانه دون التسبب في تغييرات هيكلية. وقد يؤدي الفشل في تحسين النسبة والتركيز، وكذلك دورات التجميد والذوبان المتكررة إلى التجميع عند التحميل.
كما هي مقذوف الجسيمات، وينبغي أن يكون متوسط قطر هيدرودينامية من الجسيمات النانوية السيليكون مسامية fusogenic تقاس بتشتت الضوء الحيوي ما يقرب من 200 نانومتر ومتوسط زيتا المحتملة تقريبا إيجابية سبعة ملليفولت. بعد تعديل السطح مع الببتيدات المستهدفة، يجب أن يكون القطر الإجمالي أقل من 230 نانومتر، وينخفض متوسط إمكانات زيتا إلى ناقص 3.4 ملليفولت. يمكن تأكيد الانصهار عن طريق وضع العلامات على الدهون fusogenic مع الفلوروفور الدهنية DiI ومراقبة في التعريب في المختبر باستخدام المجهر confocal.
ويلاحظ الانصهار الناجح عندما الدهون في جسيمات السيليكون النانوية المسامية fusogenic نقل DiI إلى غشاء البلازما و مترجم مستقلة عن lysosomes. سوف تظهر الانصهار غير ناجحة توطين DiI داخل السيتوبلازم الخلية والتعريب المشترك مع lysosomes. هذا النظام النانوي fusogenic الآن تستخدم للتطبيقات العلاجية في الالتهابات البكتيرية ليس فقط ولكن أيضا في العلاج السرطان المساعد والعلاج المناعي للسرطان.
قد يكون هذا البروتوكول الأمثل لتحميل أكثر من siRNAs. وقد أظهر نظام الجسيمات النانوية fusogenic إمكانات في تحميل وتسليم حمولات أنيونية أكبر حجما، مثل MRNAs ومجمعات CRISPR/Cas9.
