Этот протокол описывает синтез системы наночастиц, которая способна заглушать гены in vivo, обеспечивая siRNAs с высокой эффективностью. Просто обмениваясь целевым пептидом и полезной нагрузкой siRNA, фузогенные наночастицы могут быть использованы в качестве потенциальной терапевтической формулировки для заболеваний, которые требуют модуляции гена in vivo. Ранее мы опубликовали результаты использования фузогенной наноплатформы против грамположительных бактериальных инфекций, заглушая ген, который кодирует для воспаления в макрофагах, чтобы прекратить хроническое воспаление.
Перед выполнением этой процедуры, собрать тефлоновый etch ячейки, содержащие кремниевые пластины в три к одному раствора гидрофторной кислоты. Вы запустите переменный ток квадратной формы волны с низкой плотностью тока 50 миллиампер на сантиметр в квадрате в течение 0,6 секунды и высокой плотностью тока 400 миллиампер на сантиметр в квадрате в течение 0,36 секунды повторяется в течение 500 циклов. Как только травление закончено, удалите клетку из цепи и тщательно прополощите раствор гидрофторной кислоты с помощью шприца.
Затем трижды промыть этанолом. Чтобы снять пористый слой с кремниевой пластины, сначала заполните колодец травяной клетки 10 миллилитров раствора гидрофторной кислоты от одного до 29. Затем запустите константу 3,7 миллиампера на сантиметр в квадрате в течение 250 секунд.
Как только травление закончено, удалите ячейку из цепи. Пористый слой кремния может иметь видимые рябь, что указывает на отслоение от кристаллической кремниевой пластины. Аккуратно промыть раствор гидрофторной кислоты и промыть по три раза этанолом и водой.
Используя наконечник пипетки, твердо трещины окружности пористого кремниевого слоя для полного отслоения. Используя этанол, соберите пористые фрагменты кремния, или чипы, из тефлоновой травяной клетки в лодку для взвешивания. Затем перенесите чипсы на стеклянный флакон для хранения.
Затем замените этанол в стеклянном флаконе, содержащем пористую кремниевую стружку, двумя миллилитров воды без RNase. Твердо крышка и печать флакон с помощью Parafilm. Поместите стеклянный флакон в ванну sonicator и приостановлено таким образом, что объем пористых кремниевых чипов полностью погружены под поверхностью водяной ванны.
Чтобы предотвратить значительную потерю воды во время звуковой связи, поместите объемную колбу, наполненную водой, перевернутую так, чтобы отверстие колбы касаось поверхности водяной бани. Затем sonicate пористые кремниевые чипы в течение 12 часов на 35 килогерц с RF мощностью 48 Вт. После sonication, поместите стеклянный флакон на плоскую поверхность в течение одного часа, чтобы более крупные частицы оседают на дне.
Затем соберите супернатант с помощью пипетки. В стеклянный флакон добавьте 72,55 микролитров раствора DMPC, 15,16 микролитров раствора DSPE-PEG и 19,63 микролитров раствора DOTAP и смешайте с помощью пипетки. Поместите флакон в дымовой капот с свободной крышкой, чтобы растворитель испарился на ночь.
Высушенная пленка будет облачным, твердым, гелеобразным веществом на дне флакона. Далее поместите микроцентрифуговую трубку, содержащую 150 микролитров пористых кремниевых наночастиц, в ранее подготовленную ледяную звуковую ванну. Под 15-минутной ультразвуковой системой аккуратно пипетки 150 микролитров сирны и 700 микролитров двухмяльного хлорида кальция в пористые кремниевые наночастицы.
Удалить трубку, содержащую один миллилитр siRNA-загруженных кальция покрытием пористых кремниевых наночастиц из sonicator. Заполните широкий стакан с деионизированной водой. Замочите поликарбонатную мембрану и четыре фильтра, плавая их на поверхности воды.
Затем соберите набор экструзии липосомы, следуя инструкциям производителя. Затем увлажняйте высушенную липидную пленку в стеклянном флаконе одним миллилитром пористых кремниевых наночастиц с покрытием siRNA. Пипетка до тех пор, пока все липиды не поднялись со дна флакона и не наблюдается мутный, однородный раствор.
Добавьте магнитный перемешивая адвокатский стойку к стеклянному флакону, и поместите флакон на горячую плиту для того чтобы нагреть частицы до 40 градусов Celsius пока магнитно помешивая разрешение на 20 минут. После этого прикрепите пустой шприц к одной стороне экструдера. Затем заполните еще один шприц одним миллилитром пористого кремниевого наночастица с липидным покрытием и прикрепите шприц к другой стороне экструдера.
Начните экструзию, нажав поршень медленно, чтобы подтолкнуть частицы от одного шприца, через поликарбонатную мембрану, и в другой шприц. Повторите 20 раз. Затем соберите экструдированные частицы в микроцентрифугную трубку.
Приготовьте пептидный бульон с концентрацией пептида по миллиграмму на миллилитр в воде, свободной от RNase. В микроцентрифуговую трубку, содержащую фузогенные липидные пористые кремниевые наночастицы, аккуратно добавить 100 микролитров пептидного бульона и пипетку. Держите трубку статичной при комнатной температуре в течение 20 минут.
Чтобы удалить избыток пептида или siRNA и других excipients, мыть в 30-килодальтон центробежный фильтр, вращаясь на 5000 раз г при комнатной температуре в течение одного часа. Центрифуга еще два раза с одним миллилитром PBS в тех же настройках. После центрифугации, повторное использование окончательного пептида спряженных фузогенных липидов покрытием пористых кремниевых наночастиц в PBS при желаемой концентрации.
Частицы могут быть aliquoted и храниться при температуре минус 80 градусов по Цельсию, по крайней мере 30 дней. Успешный синтез фузогенных пористых кремниевых наночастиц должен производить однородный, слегка непрозрачный раствор, который может храниться в течение 30 дней и оттаивать, не вызывая структурных изменений. Неспособность оптимизировать соотношение и концентрацию, а также неоднократные циклы замораживания-оттепели могут привести к агрегированию при загрузке.
По мере экструдирования частиц средний гидродинамический диаметр фузогенных пористых кремниевых наночастиц, измеряемых динамическим рассеянием света, должен быть примерно 200 нанометров, а средний зета-потенциал примерно положительные семь милливольт. После модификации поверхности с целевыми пептидами общий диаметр должен быть менее 230 нанометров, а средний зета-потенциал уменьшается до минус 3,4 милливольт. Слияние может быть подтверждено путем маркировки фузогенных липидов с липофилическим флюорофором DiI и наблюдения локализации in vitro с помощью конфокальной микроскопии.
Успешное слияние наблюдается, когда фузогенные пористые липиды кремниевой наночастицы передают DiI в плазменную мембрану и локализируются независимо от лизосом. Неудачное слияние покажет локализацию DiI в цитоплазме клетки и ко-локализацию с лизосомами. Эта фузогенная система наночастиц в настоящее время используется для терапевтического применения не только в бактериальных инфекциях, но и в адъювантной терапии рака и иммунотерапии рака.
Этот протокол может быть дополнительно оптимизирован для загрузки больше, чем siRNAs. Система фузогенных наночастиц продемонстрировала потенциал в погрузке и доставке более крупных анионных полезных нагрузок, таких как мРНК и комплексы CRISPR/Cas9.
