このプロトコルは、高効率でsiRNAを送達することによって生体内の遺伝子を沈黙させることができるナノ粒子系の合成を記述する。標的ペプチドとsiRNAペイロードを単に交換するだけで、発煙性ナノ粒子を生体内遺伝子変調を必要とする疾患の潜在的な治療製剤として使用することができる。我々は以前、マクロファージの炎症をコードする遺伝子をサイレンシングして慢性炎症を終結させることによって、グラム陽性細菌感染に対する発がん性ナノプラットフォームを用いた結果を発表した。
この手順を実行する前に、シリコンウエハを含むテフロンエッチングセルを3対1のフッ化水素酸溶液に組み立てます。低電流密度が50mmの方が0.6秒、高電流密度が400mmの高電流密度を500サイクルで0.36秒四方にして、四方波の交流を実行します。エッチングが終了したら、回路から細胞を取り出し、注射器を使用してフッ化水素酸溶液を慎重にリンスします。
次に、エタノールで3回リンスする。シリコンウエハから多孔質層を持ち上げるには、まず1~29のフッ化水素酸溶液を10ミリリットルでエッチングセルのウェルを充填する。その後、250秒間、1センチメートルあたり3.7ミリアンペアの定数を250秒間実行します。
エッチングが終了したら、回路からセルを取り外します。多孔質シリコン層は、可視のリップルを有し得、結晶シリコンウエハからの剥離を示す。フッ化水素酸溶液を軽く洗い流し、エタノールと水でそれぞれ3回洗い流します。
ピペットチップを使用して、多孔質シリコン層の円周をしっかりと割り、完全に剥離します。エタノールを使用して、多孔質シリコンフラグメント、またはチップをテフロンエッチングセルから計量ボートに回収する。その後、チップをガラスバイアルに移して保管します。
次に、多孔質シリコンチップを含むガラスバイアル内のエタノールを、RNaseフリー水2ミリリットルに交換する。パラフィルムを使用してバイアルをしっかりとキャップして密封します。ガラスバイアルをソニカレーター浴に入れ、多孔質シリコンチップの体積が水浴の表面の下に完全に沈むように吊り下げます。
超音波処理中に大きな水の損失を防ぐために、フラスコの開口部が水浴の表面に触れるように反転し、水で満たされた体積フラスコを置きます。次に、48ワットのRF電力で35キロヘルツで12時間多孔質シリコンチップを超音波処理します。超音波処理の後、より大きな粒子が底に落ち着くように1時間平らな表面にガラスバイアルを置きます。
次に、ピペットを用いて上清を回収する。ガラスバイアルに、DMPC溶液72.55マイクロリットル、DSPE-PEG溶液15.16マイクロリットル、および19.63マイクロリットルのDOTAP溶液を加え、ピペット処理で混合します。溶剤が一晩蒸発できるように、緩いキャップを持つヒュームフードにバイアルを置きます。
乾燥したフィルムは、バイアルの底に濁った、硬い、ゲル状の物質になります。次に、150マイクロリットルの多孔質シリコンナノ粒子を含むマイクロ遠心チューブを、以前に調製した氷の超音波浴に入れる。15分間の超音波処理の下で、穏やかにsiRNAの150マイクロリットルと2モル塩化カルシウム700マイクロリットルを多孔質シリコンナノ粒子にピペット。
siRNAに積まれたカルシウム被覆の多孔質シリコンナノ粒子を1ミリリットル含むチューブを超音波処理器から取り出します。広いビーカーに脱イオン水を入れます。ポリカーボネート膜と4つのフィルターサポートを水面に浮かべて浸します。
次に、メーカーの指示に従ってリポソーム押出キットを組み立てます。次に、乾燥した脂質膜をガラスバイアルに1ミリリットルのsiRNA付きカルシウム被覆多孔質シリコンナノ粒子で水和する。ピペットは、全ての脂質がバイアルの底部から持ち上げられ、濁った、均質な溶液が観察される。
ガラスバイアルに磁気攪拌バーを追加し、ホットプレートにバイアルを置き、粒子を摂氏40度に加熱し、溶液を20分間磁気的に攪拌します。これに続いて、押出機の片側に空の注射器を取り付けます。次に、脂質被覆多孔質シリコンナノ粒子溶液の1ミリリットルで別のシリンジを充填し、押出機の反対側にシリンジを取り付ける。
ピストンをゆっくりと押し込んで、1つのシリンジからポリカーボネート膜を通り、もう一方のシリンジに粒子を押し込んで押し出し始めます。20 回繰り返します。次いで、押出粒子をマイクロ遠心チューブに集める。
RNaseフリー水中の1ミリグラム/ミリリットルのペプチド濃度でペプチドストックを調製します。二色原性脂質被覆多孔質シリコンナノ粒子を含むマイクロ遠心分離管に、ペプチドストックの100マイクロリットルを加え、ピペットを穏やかに添加する。室温で20分間静かにチューブを保ちます。
余分なペプチドまたはsiRNAおよび他の賦形剤を除去するために、室温で5,000回gで1時間回転させることによって30キロダルトン遠心フィルターで洗浄する。遠心分離機同じ設定の下でPBSの1ミリリットルでさらに2回。遠心分離後、PBS中の最終的なペプチド共役二元性脂質被覆多孔質シリコンナノ粒子を所望の濃度で再懸濁する。
粒子は、少なくとも30日間マイナス80度でアリクォートされ、保存することができます。二種性多孔質シリコンナノ粒子の合成に成功すると、30日間保存され、構造変化を引き起こすことなく解凍することができる均質でわずかに不透明な溶液を生成する必要があります。比と濃度を最適化できないだけでなく、凍結融解サイクルを繰り返し行えば、読み込み時に凝集する可能性があります。
粒子が押し出されると、動的光散乱によって測定されるフソジェニック多孔質シリコンナノ粒子の平均流体力学的直径は、約200ナノメートル、平均ゼータ電位はほぼ正の7ミリボルトであるべきである。標的ペプチドによる表面修飾後、全体の直径は230ナノメートル未満にする必要があり、ゼータ電位の平均はマイナス3.4ミリボルトに減少します。融合は、脂溶性フルオロフォアDiIでフゾゲン性脂質を標識し、共焦点顕微鏡を用いてインビトロ局在化を観察することによって確認することができる。
融合に成功するのは、フソジェニック多孔質シリコンナノ粒子の脂質がDiIを原形質膜に転移し、リソソームとは独立して局在化する場合に観察される。失敗した融合は細胞の細胞質内のDiIの局在化およびリソソームとの共局在化を示す。このフソジェニックナノ粒子系は、細菌感染のみならず、がんアジュバント療法やがん免疫療法においても治療用途に利用されています。
このプロトコルは、siRNA より多くをロードするようにさらに最適化できます。この機体発生性ナノ粒子系は、mRNAやCRISPR/Cas9複合体などのより大きなアニオンペイロードの読み込みと送達の可能性を示している。
