פרוטוקול זה יעזור לחוקרים ליצור סוג חדש של מודל העכבר כדי לסכם מחדש את התפתחות סרטן השד האנושי מתת-קבוצות שונות של תאי אפיתל חלביים. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים ליצור מודלים של עכבר סרטן השד ברקמת שלב התפתחותית על סוג התא באופן ספציפי וללא צורך ברביית עכברים נרחבת. כדי להתחיל בהליך זה, צור, תחזק והרשיע עכברים מנופפים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
הביאו את העכבר לאזור נפרד מהמקום שבו יש לבצע את הניתוח. לאחר אישור הרדמה על ידי ביצוע קמצוץ הבוהן, להזריק Meloxicam כמו משכך כאבים תת עורית במינון של חמישה מיליגרם לקילוגרם כדי להתכונן להליך הכירורגי. לחשוף את האתר הכירורגי פטמה על ידי החלת מספר טיפות של קרם להסרת שיער.
הסר שמנת מוגזמת ושיער רופף באמצעות מגבות נייר רכות. גילוח אינו מומלץ למנוע נזק לפטמות. לחטא את האתר הכירורגי עם יודופרים הראשון ואחריו 70% אלכוהול ולסיים עם יישום סופי של יודופרים לשפשף.
לעשות זאת בתנועה מעגלית ממרכז אזור העבודה לכיוון הפריפריה באמצעות ספוג גזה או אפליקטור כותנה. חזור על המחזור שלוש עד ארבע פעמים. השתמש בטכניקות אספטיות לאורך כל ההליך הכירורגי.
הפוך אתר חתך על העור באורך של כ סנטימטר אחד בין שתי בלוטות החלב inguinal הרביעי. בזהירות להפריד את דש העור מן צפקקודים כדי לראות את עץ צינורי חלבי. בזהירות להחזיק את הפטמה עם מאלץ של שענים כדי להסיר את הפטמה החיצונית מבלי לחתוך את כל העור הסמוך באמצעות מספריים microdissection.
לטעון כשלושה עד חמישה microliters של תערובת הזרקת Cre-אדנווירוס לתוך מזרק המילטון 25 microliter עם מחט רכזת מתכת 33 מד מודבק. להעריך את נפח תערובת ההזרקה במזרק בהתבסס על הצבע הכחול הכלול בתערובת. בעדינות להחזיק את קצה דש העור עם פינצטה מעוגלת עדין ולהזריק את תערובת הזרקת Cre-adenovirus לאט לתוך הפטמה תוך ניטור התפשטות של צבע כחול לתוך עץ צינור החלב.
לשמור על קצב ההזרקה איטי ככל האפשר, כדי למנוע נזק לומן צינורית. זריקה תוך-צינורית מוצלחת מסומנת על ידי נוזלים מוזרקים המתפשטים בכל עץ הצינורית מבלי לדלוף לתוך תא הסטרומה. בעדינות למשוך את המחט מן הפטמה, כדי למנוע כל דליפה של הנוזל מוזרק.
בדוק את הצד הדיסטלי של בלוטת החלב או את האזור שמסביב של הפטמה מוזרק. פיזור צבע לתוך סטרומה הסמוכה כפי שמוצג כאן מצביע על הזרקת כרית שומן חלבית ולא זריקה תוך-צינורית מוצלחת. סגור את הפצעים הכירורגיים בעור עם פצעים.
מוציאים את העכבר מההרדמה ומ מניחים אותו על משטח חימום בתוך כלוב נקי להתאוששות. לפקח על התפתחות הגידול חלבי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. העכברים הנשיים הצעירים ביותר שעבורם ניתן לבצע זריקה תוך-צינורית בהצלחה הם אלה בגיל כשלושה שבועות.
אמנם עבור רוב הניסויים אינדוקציה גידול חלבי, עכברים נקבה בוגרת צעירים משמשים. הזרקה תוך-צינורית עם נפח גדול יותר של תערובת ההזרקה יכולה להתבצע בעכברים נקבה במהלך ההריון המוקדם עד הבינוני כדי למקד תאים מכתביים. כדי למקד תת-כפילויות שונות של תאי אפיתל תות-חיים עבור אינדוקציה של גידולי חום, Cre-adenoviruses תחת שליטתם של מקדמי תת-קבוצה ספציפיים שונים של תאי אפיתל ממים שימשו להזרקה.
לדוגמה Cre-adenovirus תחת שליטתו של קרטין 8 מקדם שימש כדי למקד תאים אפיתל ממים זוהר. Cre-adenovirus תחת שליטתו של קרטין 5 מקדם ממוקד שושלת בסיסית המוביל סימון גנטי של תאים אפיתל חלבי בסיסי בלבד. עבור נקבה P53 floxed עכברים הומוזיגוס עם כתב ROSA26-YFP, הזריקה האינטראדוקטאלית של קרטין 8 Cre-adenovirus הוביל להתפתחות של גידולים חלביים מספר חודשים לאחר ההזרקה.
בשל הכללתו של כתב R26-Y מותנה, תאים אפיתל הגידול סומנו בדרך כלל על ידי YFP והוא יכול להיות מזוהה על ידי ציטומטריה זרימה. התאים יכולים להיות מועשרים על ידי מיון זרימה של תאים חיוביים YFP לניתוח נוסף. הדברים החשובים ביותר שיש לזכור בעת ניסיון הליך זה הם להשתמש בנפח הזרקה קטן, להזריק לאט, וגם למשוך את המחט לאט.
בעקבות הליך זה, ניתן לפקח על התקדמות תאי האפיתל החלביים החיוביים של YFP לשלבים טרום ממאירים וסרטניים על ידי ציטומטריית זרימה או הכתמת שפעת חיסונית של הבלוטה המוזרקת. טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים לחקור תאים ממוצא של סרטן השד, כיצד הם מגיבים לאירועים אוטוגניים שונים וכיצד הם מתקדמים לתאים סרטניים. הן אדנווירוס והן המחט להזרקה עלולים להיות מסוכנים.
לכן, יש תמיד ללבוש כפפות ולהשתמש מחטי בטיחות ומזרקים בעת ביצוע הזרקה תוך-צינורית.
