Spectroscopie d’absorbance atomique pour mesurer les pools de zinc intracellulaire dans les cellules de mammifères

Le rôle des métaux de transition dans le développement des mammifères est largement sous-estimé. Les preuves émergentes montrent que l’homéostasie métallique continue de changer selon le stade de développement des cellules et des tissus. En outre, les destinations cellulaires spécifiques des métaux également variétale en développement, et bien sûr, il est difficile d’identifier leur emplacement.

À ce jour, différentes techniques d’analyse ont été développées pour quantifier les métaux, mais la plupart sont coûteuses ou inaccessibles. La recherche intensive est axée sur l’amélioration des déterminations des métaux d’une manière plus accessible et plus efficace. La spectroscopie d’absorption atomique de four de graphite, GF-AAS, a deux avantages principaux.

Il fournit de faibles limites de détection pour le zinc, permettant une analyse précise du zinc trace. C’est aussi une technique qui ne nécessite pas de volumes élevés d’échantillons, les microlitres de solution ont tendance à être suffisants pour effectuer l’analyse. La combinaison de ces deux avantages rend GF-AAS idéal pour analyser les oligo-éléments dans les échantillons à faible volume.

Plusieurs conditions pathologiques humaines sont liées à des déséquilibres métalliques. Quelques exemples sont anémie, enteropathica d’acrodermatitis, et Wilson et Menkes’diseases. Par conséquent, il est important de mettre au point des méthodes efficaces et fiables pour mesurer les niveaux de métaux de transition dans les échantillons biologiques avec une sensibilité et une précision élevées.

GF-AAS est un excellent exemple sur une technologie qui facilite la détermination de tout métal donné dans des conditions physiologiques normales, et dans les cas pathogènes. La méthode est très polyvalente. Il peut être appliqué à de nombreux systèmes et de nombreux éléments peuvent être l’analyse en utilisant GF-AAS.

Les défis sont d’établir la limite de détection de la méthode dans la réalité, en s’assurant que les échantillons entrent dans cette limite. Étant donné que le volume d’échantillons est faible, il n’y a pas beaucoup de place pour les tests, un examen aussi attentif des données doit avoir lieu depuis le tout début. Après la première analyse des échantillons, nous devons établir quel est le facteur de dilution nécessaire pour amener les échantillons aux limites requises pour la quantification.

Assurez-vous que vous êtes en mesure de fractionner les noyaux correctement avant d’aller à l’AAS. Les taches occidentales sont toujours une bonne validation avant l’analyse spectroscopique. Bien que le GF-AAS nécessite de faibles volumes, les piscines intracellulaires sont déjà en faibles volumes.

Cela laisse peu de place aux tests. Les premières mesures doivent être soigneusement effectuées et examinées, de sorte que le traitement de l’échantillon peut être réduit au minimum à un seul facteur de dilution. Pour commencer, la culture des cellules d’intérêt dans les plaques de 55 centimètres carrés.

Utilisez un piège à vide pour aspirer les médias culturels. Assurez-vous d’enlever toutes les traces de médias. Utilisez du PBS glacé exempt de calcium et de magnésium pour rincer les cellules des points de temps désirés, ou des conditions de culture, trois fois.

Ajouter ensuite un millilitre de PBS glacé à la plaque et racler les cellules de la plaque. Transférez les suspensions cellulaires dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et gardez-les sur la glace. Centrifugeuse pendant 10 secondes à 10 000 fois G, et enlever le supernatant par aspiration.

Si l’analyse métallique des fractions cytoplasmiques et nucléaires est souhaitée, résuspendez la pastille cellulaire dans 400 microlitres de PBS glacé contenant 0,1 %NP-40, un détergent non ionique. Transférez 100 microlitres dans un nouveau tube de microcentrifugeuse comme échantillon cellulaire entier et rangez-le à moins 20 degrés Celsius. Pour isoler les noyaux, utilisez une pointe de micropipette P1000 pour pipette la suspension cellulaire de 400 microlitres de haut en bas cinq à dix fois sur la glace.

Ensuite, extraire cinq microlitres de la suspension cellulaire et le transférer sur une lame de verre microscope. Placez les cinq microlitres sous un microscope léger à l’aide d’un objectif de 40 fois pour vérifier l’intégrité des noyaux. Centrifugeuse les 395 cellules microlitres restantes lysent la suspension pendant 10 secondes à 10 000 fois G.Transférez le supernatant contenant la fraction cytosolique dans un nouveau tube de microcentrifugeuse.

Ensuite, ajoutez 500 microlitres du PBS contenant 0,1%NP-40 pour rincer la pastille avec la fraction nucléaire, et centrifugeuse pendant 10 secondes à 10 000 fois G.Retirez le supernatant, et réutilisez la pastille contenant les noyaux en 100 microlitres de la même solution. Pour lyse les cellules, utilisez un biorupteur pour sonifier l’ensemble de la cellule et les noyaux contenant la solution trois fois, chacun pendant cinq minutes. Procéder à un contrôle de la qualité de la pureté des fractions par tache occidentale, en utilisant des anticorps spécifiques pour les fractions nucléaires ou cytosoliques.

Tout d’abord, ajoutez un volume égal d’acide nitrique concentré de qualité oligo-métallique à l’ensemble des fractions cellulaires, cytoplasmiques et nucléaires contenant 100, 500 et 100 microlitres de suspension cellulaire dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre, et placez-les dans un bloc thermique à 80 degrés Celsius pour minéraliser la culture cellulaire pendant une heure. Après cela, sortez les tubes du bloc thermique et placez-les dans un rack pour continuer la digestion acide pendant la nuit à 20 degrés Celsius. Arrêtez la réaction en ajoutant 30 % du volume de l’échantillon de peroxyde d’hydrogène.

Porter le volume de l’échantillon à 500 microlitres avec 18 méga ohm eau purifiée. Ensuite, dans un tube Falcon de 15 millilitres diluer l’oxyde nitrique standard de qualité analytique dans l’eau purifiée à 18 méga Ohms pour préparer deux volumes pour cent solution acide nitrique comme solution vierge pendant l’étalonnage. Ensuite, utilisez la solution d’acide nitrique à deux volumes pour diluer une solution de stock de zinc disponible dans le commerce de 1000 ppm avec une concentration de 1000 parties par milliard.

Préparez des solutions standard de travail à partir de la solution standard de 1000 parties par million de zinc, la solution de 1000 parties par milliard, puis diluez-la à 5, 8, 10, 15, 20 et 25 ppb directement avec une solution d’acide nitrique à 2 pour cent de volume. Placez un millilitre de modificateur matricielle nitrate de magnésium de 0,1 % dans des tasses d’échantillon de polypropylène, puis chargez les tasses dans le carrousel autosampler. Programmez le spectromètre d’absorption atomique pour ajouter automatiquement cinq microlitres du modificateur matriciel aux normes de zinc et au blanc.

Réglez la même condition optimisée sur le spectromètre d’absorption atomique pour les solutions standard et les échantillons, avec un débit d’introduction de 250 millilitres par minute, une température d’injection à 20 degrés Celsius et une température du four graphite atteignant 1 800 degrés Celsius en quatre étapes. Toutes les normes et échantillons d’une seule expérience doivent être mesurés en même temps afin d’éviter les erreurs dues à des différences d’étalonnage ou d’évaporation. Optimisez la lampe C-HCL à un courant de 20 ampères, longueur d’onde de 213,9 nanomètres et fente de 0,7 nanomètre.

Pipette les échantillons dans des tasses d’échantillon de polypropylène, et les placer dans le carrousel autosampler. La limite inférieure de détection du zinc est de 0,01 partie par milliard. En augmentant la concentration des normes, la limite supérieure de détection du zinc est déterminée à 20 parties par milliard.

Une fois qu’une courbe standard de zinc est obtenue, mesurez les échantillons minéralisés pour déterminer la teneur en métaux. Si les données obtenues dépassent la limite de détection, diluer les échantillons avec de l’eau purifiée Ohm de 18 méga traités avec de l’acide nitrique de qualité analytique de 0,1 %. Dans cet isolement rapide du protocole des noyaux, une tache occidentale représentative des myoblastes primaires différeciants montre la pureté des fractions subcellulaires.

L’enzyme de remodeleur de chromatine Brg1 a été employée pour identifier la fraction nucléaire, et la tubuline a été employée pour identifier la fraction cytosolic. Cette figure montre des micrographes lumineux représentatifs pour proliférer et des monocouches différenciées ou confluentes de chaque type de cellule, et la teneur correspondante en zinc dans des extraits de cellules entières, des fractions cytosoliques et nucléaires. Toutes les lignées cellulaires analysées dans cette étude ont montré des concentrations de zinc dans la gamme nanomolaire.

Les myotubes primaires différenciés présentaient des niveaux plus élevés de zinc que les cellules proliférantes. Une distribution subcellulaire semblable de zinc a été détectée dans la ligne cellulaire dérivée de neuroblastoma N2A. D’autre part, la lignée cellulaire établie 3T3-L1 présentait des niveaux plus élevés de zinc lorsque les pré-adipocytes prolifédèrent que lorsqu’ils étaient induits ou différenciés.

Les cellules MCF10A ont montré des niveaux égaux de zinc entre les fractions cytosoliques et nucléaires dans les cellules proliférantes. Une fois que les cellules MCF10A atteignent la confluence, une diminution de 40% des niveaux entiers de zinc de cellules a été détectée, et le métal s’est trouvé le plus concentré dans la fraction cytosolic. La spectrométrie d’absorption atomique du four graphite est une technique très sensible pour mesurer la transition et les métaux lourds dans les échantillons biologiques et environnementaux.

Un soin et une propreté spéciaux dans la préparation des fractions subcellulaires devraient être pris, car une contamination minimale interférera probablement avec l’analyse, en raison de la sensibilité de l’équipement. Compte tenu des faibles volumes et des niveaux de traces de métaux dans chaque expérience, il est difficile de penser à une technique meilleure et plus précise pour mesurer le zinc que le GF-AAS. Il n’existe actuellement aucune technologie qui puisse fournir les limites de détection et de faible volume requises au coût relativement faible du GF-AAS.

La spectrométrie d’absorption atomique du four graphite est précise, sensible, rentable et accessible. Cette technique analytique continuera de s’améliorer à mesure que les technologies élémentaires de détection continueront de progresser. L’application future pour la détection du zinc et d’autres métaux par GF-AAS inclura des organes, des tissus obtenus des modèles animaux, et des biopsies des patients présentant la maladie liée aux déséquilibres systémiques de métal.

L’acide nitrique est un acide extrêmement corrosif capable de causer de graves brûlures chimiques très rapidement. Ce produit chimique peut également réagir violemment avec certains composés tels que les poudres métalliques. En raison du danger posé par l’acide nitrique, il est important de prendre des mesures de sécurité strictes chaque fois que vous manipulez de l’acide nitrique.

Lorsque vous manipulez de l’acide nitrique, nous vous recommandons fortement de porter des lunettes chimiques de sécurité, un écran facial pour la protection contre les éclaboussures, des gants et une respiration de vapeur approuvée si la ventilation n’est pas adéquate.