O papel dos metais de transição no desenvolvimento dos mamíferos é em grande parte subestimado. Evidências emergentes mostram que a homeostase metálica continua a mudar de acordo com o estágio de desenvolvimento das células e tecidos. Além disso, os destinos celulares específicos dos metais também variam em desenvolvimento, e, claro, é desafiador identificar sua localização.
Até o momento, diferentes técnicas analíticas foram desenvolvidas para quantificar metais, mas a maioria é cara ou inacessível. A pesquisa intensiva é focada para melhorar as determinações metálicas de forma mais acessível e eficiente. Espectroscopia de absorção atômica do forno de grafite, GF-AAS, tem duas principais vantagens.
Fornece baixos limites de detecção para zinco, permitindo uma análise precisa do zinco. É também uma técnica que não requer grandes volumes de amostra, microliters de solução tendem a ser suficientes para realizar a análise. A combinação dessas duas vantagens torna o GF-AAS ideal para analisar elementos de rastreamento em amostras de baixo volume.
Várias condições patológicas humanas estão relacionadas a desequilíbrios metálicos. Alguns exemplos são anemia, acrodermatite enteropathica e doenças de Wilson e Menkes. Por isso, é importante desenvolver métodos eficientes e confiáveis para medir os níveis de metais de transição em amostras biológicas com alta sensibilidade e precisão.
GF-AAS é um excelente exemplo em uma tecnologia que facilita a determinação de qualquer metal em condições fisiológicas normais e em casos patogênicos. O método é muito versátil. Pode ser aplicado a muitos sistemas e muitos elementos podem ser análises usando GF-AAS.
Os desafios são estabelecer o limite de método de detecção na realidade, garantindo que as amostras se enquadram nesse limite. Dado o fato de que o volume de amostras é baixo, não há muito espaço para testes, por isso o exame cuidadoso dos dados precisa ocorrer desde o início. Após a primeira análise das amostras, precisamos estabelecer qual é o fator de diluição necessário para levar as amostras aos limites necessários para quantificação.
Certifique-se de que você é capaz de fracionar os núcleos corretamente antes de ir para o AAS. Manchas ocidentais são sempre uma boa validação antes da análise espectroscópica. Enquanto o GF-AAS requer volumes baixos, as piscinas intracelulares já estão em volumes baixos.
Isso dá pouco espaço para testes. As primeiras medidas precisam ser cuidadosamente feitas e examinadas, para que o tratamento amostral possa ser minimizado para apenas um fator de diluição. Para começar, cultura as células de interesse em placas de 55 centímetros quadrados.
Use uma armadilha de vácuo para aspirar a mídia cultural. Certifique-se de remover todos os traços da mídia. Use PBS gelado livre de cálcio e magnésio para enxaguar as células dos pontos de tempo desejados, ou condições de cultura, três vezes.
Em seguida, adicione um mililitro de PBS gelado à placa, e raspe as células da placa. Transfira as suspensões celulares para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e mantenha-a no gelo. Centrifugar por 10 segundos a 10.000 vezes G, e remover o supernatante por aspiração.
Se for desejada a análise metálica de frações citoplasmáticas e nucleares, resuspenque a pelota celular em 400 microliters de PBS gelado contendo 0,1%NP-40, um detergente não iônico. Transfira 100 microliters para um novo tubo de microcentrifuuge como amostra de células inteiras, e armazene-o a menos 20 graus celsius. Para isolar os núcleos, use uma ponta de micropipette P1000 para pipeta a suspensão celular de 400 microliter para cima e para baixo cinco a dez vezes no gelo.
Em seguida, extraia cinco microlitros da suspensão celular e transfira-o para um deslizamento de vidro microscópio. Coloque os cinco microlitros sob um microscópio leve usando um objetivo de 40 vezes para verificar a integridade dos núcleos. Centrifugar a suspensão de 395 microliter lysate de células restantes por 10 segundos a 10.000 vezes G.Transfira o supernatante contendo a fração citosófica para um novo tubo de microcentrifuuagem.
Em seguida, adicione 500 microliters do PBS contendo 0,1%NP-40 para enxaguar a pelota com a fração nuclear, e centrífuga por 10 segundos a 10.000 vezes G.Remova o supernante e resuspenque a pelota contendo os núcleos em 100 microliters da mesma solução. Para lise as células, use um Bioruptor para sonicar toda a célula e núcleos contendo solução três vezes, cada uma por cinco minutos. Prossiga para realizar o controle de qualidade da pureza das frações por mancha ocidental, usando anticorpos específicos para as frações nucleares ou citosóicas.
Primeiro, adicione um volume igual de ácido nítrico concentrado de grau metálico de traço a toda a célula, citoplasmática e frações nucleares contendo 100, 500 e 100 microliters de suspensão celular em tubos de microcentrifuge de 1,5 mililitro, e coloque-os em um bloco térmico a 80 graus celsius para mineralizar a cultura celular por uma hora. Depois disso, retire os tubos do bloco térmico e coloque-os em um rack para continuar a digestão ácida durante a noite a 20 graus celsius. Pare a reação adicionando 30% do volume amostral de peróxido de hidrogênio.
Leve o volume amostral para 500 microliters com 18 mega Ohm de água purificada. Em seguida, em um tubo Falcon de 15 mililitros dilui óxido nítrico padrão de grau analítico em água purificada a 18 mega Ohms para preparar dois por cento de volume solução de ácido nítrico como a solução em branco durante a calibração. Em seguida, use a solução de ácido nítrico de dois volumes para diluir uma solução comercialmente disponível de 1.000 ppm de zinco com uma concentração de 1.000 partes por bilhão.
Prepare soluções padrão de trabalho a partir da solução padrão de 1.000 partes por milhão de zinco, a solução de 1.000 partes por bilhão, em seguida, dilui-a para 5, 8, 10, 15, 20 e 25 ppb diretamente com 2 volumes por cento solução de ácido nítrico. Coloque um mililitro de 0,1% de modificador de matriz de nitrato de magnésio em copos de amostra de polipropileno e, em seguida, carregue os copos no carrossel autosampler. Programe o espectrômetro de absorção atômica para adicionar automaticamente cinco microliters do modificador de matriz aos padrões de zinco e ao em branco.
Defina a mesma condição otimizada no espectrômetro de absorção atômica para as soluções padrão e as amostras, com taxa de fluxo de introdução em 250 mililitros por minuto, temperatura de injeção a 20 graus celsius e temperatura do forno de grafite atingindo 1.800 graus celsius em quatro processos de etapa. Todos os padrões e amostras de um único experimento devem ser medidos ao mesmo tempo para evitar erros devido a diferenças de calibração ou evaporação. Otimize a lâmpada C-HCL a uma corrente de 20 amperes, comprimento de onda de 213,9 nanômetros e fenda de 0,7 nanômetros.
Pipeta as amostras em copos de amostra de polipropileno, e coloque-as no carrossel autosampler. O limite mais baixo de detecção de zinco é de 0,01 partes por bilhão. Ao aumentar a concentração dos padrões, o limite superior de detecção de zinco é determinado em 20 partes por bilhão.
Após a obtenção de uma curva padrão de zinco, meça as amostras mineralizadas para determinar o teor de metal. Se os dados obtidos ultrapassarem o limite de detecção, diluir as amostras com 18 mega Água Purificada Ohm tratada com ácido nítrico de grau analítico de 0,1%. Neste rápido isolamento do protocolo dos núcleos, uma mancha ocidental representativa de diferenciar myoblasts primários mostra a pureza das frações subcelulares.
A enzima remodelador de cromatina Brg1 foi usada para identificar a fração nuclear, e tubulina foi usada para identificar a fração citosolítica. Esta figura mostra micrografias de luz representativas para monocamadas proliferadoras e diferenciadas ou confluentes de cada tipo celular, e o teor correspondente de zinco em extratos celulares inteiros, frações citosóis e nucleares. Todas as linhas celulares analisadas neste estudo mostraram concentrações de zinco na faixa de nanomolar.
Myotubes primários diferenciados apresentaram níveis mais altos de zinco do que células proliferadoras. Uma distribuição subcelular semelhante de zinco foi detectada na linha celular derivada do neuroblastoma N2A. Por outro lado, a linha celular 3T3-L1 estabelecida apresentava níveis mais elevados de zinco quando os pré-adipócitos estavam proliferando do que quando foram induzidos ou diferenciados.
As células MCF10A apresentaram níveis iguais de zinco entre frações citosóicas e nucleares em células proliferadoras. Uma vez que as células MCF10A atingem confluência, uma redução de 40% nos níveis inteiros de zinco celular foi detectada, e o metal foi encontrado mais concentrado na fração citosolica. Espectrometria de absorção atômica do forno de grafite é uma técnica altamente sensível para medir a transição e metais pesados em amostras biológicas e ambientais.
Devem ser tomados cuidados especiais e limpeza na preparação de frações subcelulares, pois a contaminação mínima provavelmente interferirá na análise, devido à sensibilidade do equipamento. Dado os baixos volumes e níveis de traço de metais em cada experimento, é difícil pensar em uma técnica melhor e mais precisa para medir zinco do que o GF-AAS. Não existem técnicas atuais que possam fornecer os limites de detecção e baixo volume necessários ao custo relativamente baixo do GF-AAS.
A espectrometria de absorção atômica do forno de grafite é precisa, sensível, econômica e acessível. Esta técnica analítica continuará a melhorar à medida que as tecnologias de detecção elementar continuarem avançando. A aplicação futura para detecção de zinco e outros metais pelo GF-AAS incluirá órgãos, tecidos obtidos a partir de modelos animais e biópsias de pacientes com doenças associadas a desequilíbrios metálicos sistêmicos.
O ácido nítrico é um ácido extremamente corrosivo capaz de causar queimaduras químicas graves muito rapidamente. Este produto químico também pode reagir violentamente com certos compostos, como pós metálicos. Devido ao perigo representado pelo ácido nítrico, é importante tomar medidas rigorosas de segurança sempre que manusear ácido nítrico.
Ao manusear ácido nítrico, recomendamos fortemente que você use óculos químicos de segurança, escudo facial para proteção de respingos, luvas e respiração de vapor aprovada se a ventilação não for adequada.
