Atomische Absorbance-Spektroskopie zur Messung von intrazellulären Zink-Pools in den Mamänarchalzellen

Die Rolle von Übergangsmetallen bei der Entwicklung von Säugetieren wird weitgehend unterschätzt. Neue Erkenntnisse zeigen, dass sich die Metallhomöostase je nach Entwicklungsstadium von Zellen und Geweben weiter verändert. Darüber hinaus sind die spezifischen zellulären Destinationen von Metallen auch in der Entwicklung bunt, und natürlich ist es schwierig, ihren Standort zu identifizieren.

Bis heute wurden verschiedene Analysetechniken entwickelt, um Metalle zu quantifizieren, aber die meisten sind teuer oder unzugänglich. Die intensive Forschung konzentriert sich darauf, die Metallbestimmung auf eine zugänglichere und effizientere Weise zu verbessern. Graphitofen Atomabsorptionsspektroskopie, GF-AAS, hat zwei Hauptvorteile.

Es bietet niedrige Nachweisgrenzen für Zink, was eine genaue Spuren-Zink-Analyse ermöglicht. Es ist auch eine Technik, die keine großen Mengen an Probe erfordert, Mikroliter der Lösung neigen dazu, genug zu sein, um die Analyse durchzuführen. Die Kombination dieser beiden Vorteile macht GF-AAS ideal für die Analyse von Spurenelementen in Proben mit geringem Volumen.

Mehrere humanpathologische Bedingungen hängen mit Metallfehlgewichten zusammen. Einige Beispiele sind Anämie, Acrodermatitis enteropathica und Wilsons und Menkes'-Krankheiten. Daher ist es wichtig, effiziente und zuverlässige Methoden zu entwickeln, um den Gehalt an Übergangsmetallen in biologischen Proben mit hoher Empfindlichkeit und Genauigkeit zu messen.

GF-AAS ist ein hervorragendes Beispiel für eine Technologie, die die Bestimmung eines bestimmten Metalls unter normalen physiologischen Bedingungen und in pathogenen Fällen erleichtert. Die Methode ist sehr vielseitig. Es kann auf viele Systeme angewendet werden und viele Elemente können mit GF-AAS analysiert werden.

Die Herausforderungen bestehen darin, die Methodengrenze der Detektion in der Realität festzulegen und sicherzustellen, dass die Proben innerhalb dieser Grenze liegen. Angesichts der Tatsache, dass das Volumen der Proben gering ist, gibt es nicht viel Raum für Tests, so dass eine sorgfältige Prüfung der Daten von Anfang an stattfinden muss. Nach der ersten Analyse der Proben müssen wir ermitteln, welcher Verdünnungsfaktor erforderlich ist, um die Proben an die für die Quantifizierung erforderlichen Grenzwerte zu bringen.

Stellen Sie sicher, dass Sie in der Lage sind, die Kerne richtig zu fraktionieren, bevor Sie zum AAS gehen. Westliche Flecken sind immer eine gute Validierung vor der spektroskopischen Analyse. Während GF-AAS geringe Volumina erfordert, sind intrazelluläre Pools bereits in geringen Volumina.

Das gibt wenig Raum für Tests. Die ersten Messungen müssen sorgfältig durchgeführt und untersucht werden, so dass die Probenbehandlung auf nur einen Verdünnungsfaktor minimiert werden kann. Zu Beginn, Kultur die Zellen von Interesse in 55 Quadratzentimeter Platten.

Verwenden Sie eine Vakuumfalle, um die Kulturmedien zu saugen. Achten Sie darauf, alle Medienspuren zu entfernen. Verwenden Sie eiskalte PBS frei von Kalzium und Magnesium, um die Zellen aus den gewünschten Zeitpunkten oder Kulturbedingungen dreimal zu spülen.

Dann fügen Sie einen Milliliter eiskalte PBS auf die Platte, und kratzen Sie die Zellen von der Platte. Übertragen Sie die Zellsuspensionen auf ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr und halten Sie sie auf Eis. Zentrifuge für 10 Sekunden bei 10.000 mal G, und entfernen Sie den Überstand durch Aspiration.

Wenn eine Metallanalyse von zytoplasmatischen und nuklearen Fraktionen gewünscht ist, setzen Sie das Zellpellet in 400 Mikrolitere eiskaltem PBS mit 0,1%NP-40, einem nichtionischen Waschmittel, wieder aus. 100 Mikroliter als gesamte Zellprobe in ein neues Mikrozentrifugenrohr geben und bei minus 20 Grad Celsius lagern. Um Kerne zu isolieren, verwenden Sie eine P1000-Mikropipettespitze, um die 400-Mikroliter-Zellsuspension fünf- bis zehnmal auf Eis nach oben und unten zu pipette.

Dann extrahieren Sie fünf Mikroliter der Zellsuspension und übertragen Sie sie auf ein Mikroskopglasschlitten. Platzieren Sie die fünf Mikroliter unter ein Lichtmikroskop mit einem 40-fachen Ziel, um die Integrität der Kerne zu überprüfen. Zentrifugieren Sie die verbleibende 395 Mikroliter-Zelllysatsuspension für 10 Sekunden bei 10.000-facher G.Transfer den Überstand, der die zytosolische Fraktion enthält, in ein neues Mikrozentrifugenrohr.

Als nächstes 500 Mikroliter des PBS mit 0,1%NP-40 hinzufügen, um das Pellet mit der Kernfraktion zu spülen, und Zentrifugieren Sie 10 Sekunden lang bei 10.000 mal G.Entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie das Pellet, das die Kerne enthält, in 100 Mikroliter derselben Lösung wieder aus. Um die Zellen zu lysieren, verwenden Sie einen Bioruptor, um die gesamte Zelle und Kerne, die Eine Lösung enthalten, dreimal, jeweils für fünf Minuten, zu beschallen. Führen Sie die Qualitätskontrolle der Reinheit der Fraktionen durch westlichen Blot durch, indem Sie Antikörper verwenden, die entweder für die kerntechnischen oder zytosolischen Fraktionen spezifisch sind.

Fügen Sie zunächst der gesamten Zelle, den zytoplasmatischen und nuklearen Fraktionen, die 100, 500 und 100 Mikroliter Zellsuspension in 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren enthalten, ein gleiches Volumen an konzentrierter Salpetersäure mit Spurenmetallgrad hinzu, und legen Sie sie in einem thermischen Block bei 80 Grad Celsius, um die Zellkultur für eine Stunde zu mineralisieren. Danach nehmen Sie die Rohre aus dem Thermalblock und legen Sie sie in ein Rack, um die Säureverdauung über Nacht bei 20 Grad Celsius fortzusetzen. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie 30 % des Probenvolumens von Wasserstoffperoxid hinzufügen.

Bringen Sie das Probenvolumen auf 500 Mikroliter mit 18 Mega Ohm gereinigtem Wasser. Als nächstes, in einem 15 Milliliter Falcon Rohr verdünnt analytischen Grad Standard Stickstoffmonoxid in gereinigtem Wasser bei 18 Mega Ohms, um zwei Volumen Prozent Salpetersäure-Lösung als leere Lösung während der Kalibrierung vorzubereiten. Verwenden Sie dann die zwei Volumen prozentige Salpetersäurelösung, um eine handelsübliche 1.000 ppm Zinkstocklösung mit einer Konzentration von 1 000 Teilen pro Milliarde zu verdünnen.

Vorbereiten Sie funktionierende Standardlösungen aus der 1 000 Teil pro Million Zink-Standardlösung, der 1.000-Teil-pro-Milliarde-Lösung, und verdünnen Sie sie dann direkt auf 5, 8, 10, 15, 20 und 25 ppb mit 2 Volumen prozentweise Salpetersäurelösung. Legen Sie einen Milliliter 0,1% Magnesiumnitratmatrix-Modifikator in Polypropylen-Probenbecher und laden Sie die Tassen dann in das Autosampler-Karussell. Programmieren Sie das Atomabsorptionsspektrometer, um automatisch fünf Mikroliter des Matrixmodifizierers zu den Zinkstandards und dem Rohling hinzuzufügen.

Stellen Sie den gleichen optimierten Zustand auf dem Atomabsorptionsspektrometer für die Standardlösungen und die Proben, mit Einführungsdurchfluss von 250 Milliliter pro Minute, Injektionstemperatur bei 20 Grad Celsius und Graphitofentemperatur erreicht 1, 800 Grad Celsius in vierstufigen Prozessen. Alle Normen und Proben eines einzelnen Experiments sollten gleichzeitig gemessen werden, um Fehler aufgrund von Kalibrierungsunterschieden oder Verdunstung zu vermeiden. Optimieren Sie die Lampe C-HCL auf einen Strom von 20 Ampere, eine Wellenlänge von 213,9 Nanometern und einen Schlitz von 0,7 Nanometern.

Die Proben in Polypropylen-Probenbechern zerlegen und in das Autosampler-Karussell legen. Die untere Nachweisgrenze für Zink liegt bei 0,01 Teilen pro Milliarde. Durch die Erhöhung der Konzentration der Normen wird die Obergrenze für den Nachweis von Zink auf 20 Teile pro Milliarde festgelegt.

Messen Sie nach dem Ermessen einer Zink-Standardkurve die mineralisierten Proben, um den Metallgehalt zu bestimmen. Wenn die erhaltenen Daten über die Nachweisgrenze hinausgehen, verdünnen Sie die Proben mit 18 Mega Ohm gereinigtem Wasser, das mit 0,1% salpetersäureanalytischer Qualität behandelt wird. In dieser schnellen Isolierung des Kernprotokolls zeigt ein repräsentativer westlicher Fleck von der Differenzierung primärer Myoblasten die Reinheit subzellulärer Brüche.

Das Chromatin-Remodeler-Enzym Brg1 wurde verwendet, um die Kernfraktion zu identifizieren, und Tubulin wurde verwendet, um die zytosolische Fraktion zu identifizieren. Diese Abbildung zeigt repräsentative Lichtmikroskopie für vermehrende und differenzierte oder konfluente Monolayer jedes Zelltyps sowie den entsprechenden Zinkgehalt in ganzen Zellextrakten, zytosolischen und nuklearen Fraktionen. Alle in dieser Studie analysierten Zelllinien zeigten Zinkkonzentrationen im Nanomolar-Bereich.

Differenzierte primäre Myotuben wiesen höhere Zinkgehalte auf als vermehrende Zellen. Eine ähnliche subzelluläre Verteilung von Zink wurde in der neuroblastomabgeleiteten Zelllinie N2A nachgewiesen. Auf der anderen Seite zeigte die etablierte 3T3-L1-Zelllinie höhere Zinkgehalte, wenn sich die Präadipozyten vermehrten, als wenn sie induziert oder differenziert wurden.

MCF10A-Zellen zeigten in sich vermehrenden Zellen gleiche Zinkwerte zwischen zytosolischen und nuklearen Fraktionen. Sobald MCF10A-Zellen den Zusammenfluss erreichen, wurde eine 40%ige Abnahme des Zinkgehalts ganzer Zellen festgestellt, und es wurde festgestellt, dass das Metall am stärksten in der zytosolischen Fraktion konzentriert ist. Graphitofen Atomabsorptionsspektrometrie ist eine hochempfindliche Technik zur Messung von Übergangs- und Schwermetallen in biologischen und Umweltproben.

Besondere Sorgfalt und Sauberkeit bei der Herstellung von subzellulären Fraktionen sollten getroffen werden, da eine minimale Kontamination aufgrund der Empfindlichkeit der Ausrüstung wahrscheinlich die Analyse beeinträchtigen wird. Angesichts der geringen Mengen und Spuren von Metallen in jedem Experiment ist es schwierig, an eine bessere und genauere Technik zur Messung von Zink als GF-AAS zu denken. Es gibt keine aktuellen Techniken, die die Grenzen der Erkennung und des geringen Volumens bieten können, die zu den relativ niedrigen Kosten von GF-AAS erforderlich sind.

Graphitofen Atomabsorptionsspektrometrie ist genau, empfindlich, kostengünstig und zugänglich. Diese Analysetechnik wird sich weiter verbessern, wenn die Technologien zur Elementerkennung weiter voranschreiten. Zukünftige Anwendungen für den Nachweis von Zink und anderen Metallen durch GF-AAS umfassen Organe, Gewebe aus Tiermodellen und Biopsien von Patienten mit Krankheiten, die mit systemischen Metallungleichgewichten verbunden sind.

Salpetersäure ist eine extrem korrosive Säure, die sehr schnell schwere chemische Verbrennungen verursachen kann. Diese Chemikalie kann auch mit bestimmten Verbindungen wie metallischen Pulvern heftig reagieren. Aufgrund der Gefahr, die von Salpetersäure ausgeht, ist es wichtig, strenge Sicherheitsmaßnahmen zu ergreifen, wenn Sie mit Salpetersäure umgehen.

Beim Umgang mit Salpetersäure empfehlen wir Ihnen dringend, Sicherheitschemikaliengläser, Gesichtsschutz für Spritzschutz, Handschuhe und zugelassene Dampfatmung zu tragen, wenn die Belüftung nicht ausreicht.