El papel de los metales de transición en el desarrollo de mamíferos está en gran medida subestimado. La evidencia emergente muestra que la homeostasis metálica continúa cambiando de acuerdo con la etapa de desarrollo de las células y tejidos. Además, los destinos celulares específicos de los metales también son varietales en desarrollo, y por supuesto, es difícil identificar su ubicación.
Hasta la fecha, se han desarrollado diferentes técnicas analíticas para cuantificar metales, pero la mayoría son caros o inaccesibles. La investigación intensiva se centra en mejorar las determinaciones de metales de una manera más accesible y eficiente. La espectroscopia de absorción atómica del horno de grafito, GF-AAS, tiene dos ventajas principales.
Proporciona bajos límites de detección de zinc, lo que permite un análisis preciso del zinc traza. También es una técnica que no requiere grandes volúmenes de muestra, los microlitros de solución tienden a ser suficientes para llevar a cabo el análisis. La combinación de estas dos ventajas hace que GF-AAS sea ideal para analizar oligoelementos en muestras de bajo volumen.
Varias condiciones patológicas humanas están relacionadas con despejas de metales. Algunos ejemplos son la anemia, la acrodermatitis enteropatica y las enfermedades de Wilson y Menkes. Por lo tanto, es importante desarrollar métodos eficientes y fiables para medir los niveles de metales de transición en muestras biológicas con alta sensibilidad y precisión.
GF-AAS es un excelente ejemplo en una tecnología que facilita la determinación de cualquier metal dado en condiciones fisiológicas normales, y en casos patógenos. El método es muy versátil. Se puede aplicar a muchos sistemas y muchos elementos se pueden análisis utilizando GF-AAS.
Los retos son establecer el límite de método de detección en la realidad, asegurándose de que las muestras estén dentro de este límite. Dado el hecho de que el volumen de muestras es bajo, no hay mucho espacio para las pruebas, por lo que el examen cuidadoso de los datos debe tener lugar desde el principio. Después del primer análisis de muestras, necesitamos establecer cuál es el factor de dilución necesario para llevar las muestras a los límites requeridos para la cuantificación.
Asegúrese de que usted es capaz de fraccionar los núcleos correctamente antes de ir al AAS. Las manchas occidentales son siempre una buena validación antes del análisis espectroscópico. Mientras que GF-AAS requiere volúmenes bajos, las piscinas intracelulares ya están en volúmenes bajos.
Eso da poco espacio para las pruebas. Las primeras mediciones deben realizarse y examinarse cuidadosamente, por lo que el tratamiento de la muestra puede minimizarse a un solo factor de dilución. Para empezar, cultivo de las células de interés en placas de 55 centímetros cuadrados.
Utilice una trampa de vacío para aspirar los medios de cultivo. Asegúrese de eliminar todos los rastros de medios. Use PBS frío libre de calcio y magnesio para enjuagar las células de los puntos de tiempo deseados, o condiciones de cultivo, tres veces.
Luego agregue un mililitro de PBS helado a la placa, y raspe las células de la placa. Transfiera las suspensiones celulares a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y manténgala en hielo. Centrifugar durante 10 segundos a 10.000 veces G, y retire el sobrenadante por aspiración.
Si se desea un análisis metálico de fracciones citoprásmicas y nucleares, resuspender el pellet celular en 400 microlitros de PBS helado que contiene 0.1%NP-40, un detergente no iónico. Transfiera 100 microlitros a un nuevo tubo de microcentrífuga como muestra de celda entera, y guárdelo a menos 20 grados centígrados. Para aislar los núcleos, utilice una punta de micropipeta P1000 para pipetear la suspensión de celda de 400 microlitrados hacia arriba y hacia abajo de cinco a 10 veces en hielo.
A continuación, extraiga cinco microlitros de la suspensión celular y transfiéralos a un portaobjetos de vidrio del microscopio. Coloque las cinco microlitros bajo un microscopio de luz utilizando un objetivo de 40 veces para verificar la integridad de los núcleos. Centrifugar la suspensión de izado de celda de microlitros restante durante 10 segundos a 10.000 veces G.Transfiera el sobrenadante que contiene la fracción citosólica a un nuevo tubo de microcentrífuga.
A continuación, agregue 500 microlitros del PBS que contengan 0,1%NP-40 para enjuagar el pellet con la fracción nuclear, y centrifugar durante 10 segundos a 10.000 veces G.Retire el sobrenadante, y resuspendir el pellet que contiene los núcleos en 100 microlitros de la misma solución. Para alliceerar las células, utilice un Bioruptor para sonicar toda la célula y núcleos que contienen solución tres veces, cada uno durante cinco minutos. Proceder a realizar el control de calidad de la pureza de las fracciones por mancha occidental, utilizando anticuerpos específicos para las fracciones nucleares o citosólicas.
En primer lugar, añadir un volumen igual de ácido nítrico concentrado de grado de traza metálica a toda la célula, fracciones citoplasmas y nucleares que contengan 100, 500 y 100 microlitros de suspensión celular en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros, y colóquelos en un bloque térmico a 80 grados centígrados para mineralizar el cultivo celular durante una hora. Después de eso, saque los tubos del bloque térmico y colóquelos en un estante para continuar la digestión ácida durante la noche a 20 grados centígrados. Detenga la reacción añadiendo el 30% del volumen de la muestra de peróxido de hidrógeno.
Lleve el volumen de la muestra a 500 microlitros con 18 mega de agua purificada Ohm. A continuación, en un tubo Falcon de 15 mililitros diluye el óxido nítrico estándar de grado analítico en agua purificada a 18 mega ohmios para preparar una solución de ácido nítrico de dos por ciento de volumen como solución en blanco durante la calibración. A continuación, utilice la solución de ácido nítrico de dos volúmenes por ciento para diluir una solución de stock de zinc de 1.000 ppm disponible comercialmente con una concentración de 1.000 partes por mil millones.
Prepare soluciones estándar de trabajo a partir de la solución estándar de 1.000 partes por millón de zinc, la solución de 1.000 partes por mil millones y luego diluya a 5, 8, 10, 15, 20 y 25 ppb directamente con una solución de ácido nítrico de 2% de volumen. Coloque un mililitro de 0.1%modificador de matriz de nitrato de magnesio en vasos de muestra de polipropileno, y luego cargue las tazas en el carrusel automuestreador. Programe el espectrómetro de absorción atómica para añadir automáticamente cinco microlitros del modificador de matriz a los estándares de zinc y al espacio en blanco.
Establezca la misma condición optimizada en el espectrómetro de absorción atómica para las soluciones estándar y las muestras, con un caudal de introducción de 250 mililitros por minuto, una temperatura de inyección de 20 grados centígrados y una temperatura del horno de grafito que alcanza los 1.800 grados centígrados en cuatro procesos de paso. Todos los estándares y muestras de un solo experimento deben medirse al mismo tiempo para evitar errores debido a diferencias de calibración o evaporación. Optimice la lámpara C-HCL a una corriente de 20 amperios, longitud de onda de 213,9 nanómetros y ranura de 0,7 nanómetros.
Pipetear las muestras en tazas de muestra de polipropileno y colocarlas en el carrusel del automuestreador. El límite inferior de detección de zinc es de 0,01 partes por mil millones. Al aumentar la concentración de las normas, se determina que el límite superior de detección de zinc es de 20 partes por mil millones.
Después de obtener una curva estándar de zinc, mida las muestras mineralizadas para determinar el contenido de metal. Si los datos obtenidos están más allá del límite de detección, diluya las muestras con 18 mega Ohm de agua purificada tratadas con 0,1% de ácido nítrico de grado analítico. En este rápido aislamiento del protocolo de núcleos, una mancha occidental representativa de la diferenciación de los mioblastos primarios muestra la pureza de las fracciones subcelulares.
La enzima remodeladora de cromatina Brg1 se utilizó para identificar la fracción nuclear, y la tubulina se utilizó para identificar la fracción citosólica. Esta figura muestra micrografías ligeras representativas para las monocapas proliferantes y diferenciadas o confluentes de cada tipo de célula, y el contenido de zinc correspondiente en extractos de células enteras, fracciones citosólicas y nucleares. Todas las líneas celulares analizadas en este estudio mostraron concentraciones de zinc en el rango nanomolar.
Los miotubos primarios diferenciados exhibieron niveles más altos de zinc que las células proliferantes. Se detectó una distribución subcelular similar de zinc en la línea celular derivada del neuroblastoma N2A. Por otro lado, la línea celular 3T3-L1 establecida presentaba niveles más altos de zinc cuando los pre-adipocitos proliferaban que cuando fueron inducidos o diferenciados.
Las células MCF10A mostraron niveles iguales de zinc entre las fracciones citosólicas y nucleares en las células proliferantes. Una vez que las células MCF10A alcanzan la confluencia, se detectó una disminución del 40% en los niveles de zinc de células enteras, y se encontró que el metal estaba más concentrado en la fracción citosólica. La espectrometría de absorción atómica del horno de grafito es una técnica altamente sensible para medir la transición y los metales pesados en muestras biológicas y ambientales.
Se debe tener especial cuidado y limpieza en la preparación de fracciones subcelulares, ya que la contaminación mínima probablemente interferirá con el análisis, debido a la sensibilidad del equipo. Dados los bajos volúmenes y trazas de metales en cada experimento, es difícil pensar en una técnica mejor y más precisa para medir el zinc que el GF-AAS. No hay técnicas actuales que puedan proporcionar los límites de detección y bajo volumen requeridos a un costo relativamente bajo de GF-AAS.
La espectrometría de absorción atómica del horno de grafito es precisa, sensible, rentable y accesible. Esta técnica analítica seguirá mejorando a medida que las tecnologías de detección elemental sigan avanzando. La aplicación futura para la detección de zinc y otros metales por GF-AAS incluirá órganos, tejidos obtenidos de modelos animales y biopsias de pacientes con enfermedad asociada con desequilibrios metálicos sistémicos.
El ácido nítrico es un ácido extremadamente corrosivo capaz de causar quemaduras químicas graves muy rápidamente. Este producto químico también puede reaccionar violentamente con ciertos compuestos como polvos metálicos. Debido al peligro que supone el ácido nítrico, es importante tomar estrictas medidas de seguridad siempre que manipule ácido nítrico.
Al manipular ácido nítrico, le recomendamos encarecidamente que use gafas químicas de seguridad, protector facial para la protección contra salpicaduras, guantes y respiración de vapor aprobada si la ventilación no es adecuada.
