Роль переходных металлов в развитии млекопитающих в значительной степени недооценивается. Новые данные показывают, что металлический гомеостаз продолжает меняться в зависимости от стадии развития клеток и тканей. Кроме того, конкретные клеточные направления металлов также вариативны в развитии, и, конечно, трудно определить их местоположение.
На сегодняшний день разработаны различные аналитические методы количественной оценки металлов, однако большинство из них являются дорогостоящими или недоступными. Интенсивные исследования направлены на улучшение определения металла более доступным и эффективным образом. Графитовая печевая атомная абсорбционная спектроскопия GF-AAS имеет два основных преимущества.
Он обеспечивает низкие пределы обнаружения цинка, что позволяет точно отслеживать анализ цинка. Это также метод, который не требует больших объемов выборки, микролитров раствора, как правило, достаточно для проведения анализа. Сочетание этих двух преимуществ делает GF-AAS идеальным для анализа микроэлементов в образцах с низким объемом.
Некоторые патологические состояния человека связаны с металлическими дисбалансами. Некоторые примеры анемии, акродерматит энтеропатической, и Вильсона и Menkes'diseases. Поэтому важно разработать эффективные и надежные методы измерения уровней переходных металлов в биологических образцах с высокой чувствительностью и точностью.
GF-AAS является прекрасным примером на технологии, которая облегчает определение любого данного металла в нормальных физиологических условиях, и в патогенных случаях. Метод очень разносторонний. Он может быть применен ко многим системам и многие элементы могут быть анализа с помощью GF-AAS.
Задача заключается в установлении в реальности предела метода обнаружения, с тем чтобы образцы подпадают под этот предел. Учитывая тот факт, что объем проб низок, места для тестирования не так много, поэтому тщательный анализ данных должен проходить с самого начала. После первого анализа образцов нам необходимо установить, какой фактор разбавления необходим для того, чтобы довести образцы до пределов, необходимых для количественной оценки.
Убедитесь, что вы в состоянии дробить ядра должным образом, прежде чем идти в AAS. Западные помарки всегда хорошая проверка до спектроскопического анализа. В то время как GF-AAS требует низких объемов, внутриклеточные пулы уже находятся в низких объемах.
Это дает мало места для тестирования. Первые измерения должны быть тщательно сделаны и изучены, так что лечение образца может быть сведено к минимуму только один фактор разбавления. Для начала, культура клеток, представляющих интерес в 55 квадратных сантиметров пластин.
Используйте вакуумную ловушку, чтобы аспирировать культурные средства массовой информации. Обязательно удалите все следы мультимедиа. Используйте холодный PBS без кальция и магния, чтобы промыть клетки из желаемых точек времени, или культурных условий, в три раза.
Затем добавьте один миллилитр ледяного PBS к пластине, и соскребать клетки с пластины. Перенесите подвески клетки в 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку и держите ее на льду. Центрифуга в течение 10 секунд при 10 000 раз G, и удалить супернатант по стремлению.
Если металлический анализ цитоплазмических и ядерных фракций желан, повторно посовестите клеточные гранулы в 400 микролитров ледяного PBS, содержащего 0,1%NP-40, неионные моющие средства. Перенесите 100 микролитров в новую микроцентрифугную трубку в качестве образца всей клетки и храните ее при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Чтобы изолировать ядра, используйте наконечник микропипета P1000, чтобы пипетку 400 микролитровых клеток подвески вверх и вниз от пяти до 10 раз на льду.
Затем извлекайте пять микролитров подвески клетки и перенесите ее на стеклянную горку микроскопа. Поместите пять микролитров под световой микроскоп, используя 40-х раз цель для проверки целостности ядер. Центрифуга оставшихся 395 микролитерных клеток лизате подвески в течение 10 секунд в 10 000 раз G.Transfer супернатант, содержащий цитозоловую фракцию в новую микроцентрифугную трубку.
Затем добавьте 500 микролитров PBS, содержащих 0,1%NP-40 для полоскания гранулы ядерной фракцией, и центрифугу в течение 10 секунд при 10 000 раз G.Remove supernatant, и повторно потекут гранулы, содержащие ядра в 100 микролитров того же раствора. Чтобы вынизать клетки, используйте Bioruptor для sonicate всей клетки и ядра, содержащие раствор три раза, каждый в течение пяти минут. Продолжить для выполнения контроля качества чистоты фракций западной пятно, используя антитела, характерные для ядерных или цитозолических фракций.
Во-первых, добавить равный объем концентрированной азотной кислоты следового металла класса для всей клетки, цитоплазмы и ядерных фракций, содержащих 100, 500 и 100 микролитров клеточной подвески в 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки, и поместить их в тепловой блок на 80 градусов по Цельсию для минерализации клеточной культуры в течение одного часа. После этого вынул трубки из теплового блока и поместите их в стойку, чтобы продолжить переваривание кислоты на ночь при 20 градусах по Цельсию. Остановите реакцию, добавив 30% объема образца перекиси водорода.
Довнесите объем выборки до 500 микролитров с 18 мега ohm очищенной водой. Далее, в 15 миллилитров Сокол трубки разбавить аналитический класс стандартного оксида азота в очищенной воде на 18 мега Ohms подготовить два тома процентов азота кислоты раствор в качестве пустого раствора во время калибровки. Затем используйте двухтомный раствор азотной кислоты, чтобы разбавить коммерчески доступный раствор цинкового запаса 1000 промилле с концентрацией 1000 деталей на миллиард.
Подготовье стандартных решений из 1000 часть на миллион цинка стандартного решения, 1000 часть на миллиард раствор, а затем разбавить его до 5, 8, 10, 15, 20, и 25 ppb непосредственно с 2 тома процентов азота кислоты раствора. Поместите один миллилитр 0,1% магния нитрат матрицы модификатор в полипропилена образца чашки, а затем загрузить чашки в карусель автозампер. Запрограммировать спектрометр атомного поглощения, чтобы автоматически добавить пять микролитров матричного модификатора к стандартам цинка и пустой.
Установите такое же оптимизированное состояние на спектрометре атомного поглощения для стандартных решений и образцов, при этом скорость потока введения составит 250 миллилитров в минуту, температура впрыска 20 градусов по Цельсию и температура графитовой печи достигают 1800 градусов по Цельсию в четырех шагах. Все стандарты и образцы одного эксперимента должны быть измерены одновременно, чтобы избежать ошибок из-за различий в калибровке или испарения. Оптимизируйте лампу C-HCL до тока 20 усилителей, длину волны 213,9 нанометров и щель 0,7 нанометров.
Pipette образцы в полипропилен образца чашки, и поместить их в карусель autosampler. Нижний предел обнаружения цинка составляет 0,01 частей на миллиард. За счет увеличения концентрации стандартов верхний предел обнаружения цинка определяется как 20 частей на миллиард.
После получения стандартной кривой цинка измерьте минерализованные образцы для определения содержания металла. Если полученные данные выходят за пределы обнаружения, разбавляют образцы 18-мега-очищенной водой, обработанной азотной кислотой аналитического класса 0,1%. В этой быстрой изоляции протокола ядер репрезентативная западная помарка от дифференциации первичных миобластов показывает чистоту подклеточных фракций.
Хроматин remodeler фермент Brg1 был использован для определения ядерной фракции, и тубулин был использован для выявления цитозоловой фракции. На этом рисунке показаны репрезентативные световые микрографы для размножающихся и дифференцированных или стеченных монослой каждого типа клеток, а также соответствующее содержание цинка в экстрактах целых клеток, цитозоловых и ядерных фракциях. Все клеточные линии, проанализированные в этом исследовании, показали концентрацию цинка в наномолярном диапазоне.
Дифференцированные первичные миотрубы продемонстрировали более высокий уровень цинка, чем размножающиеся клетки. Аналогичное субклеточное распределение цинка было обнаружено в нейробластоме, полученной клеточной линией N2A. С другой стороны, установленная клеточная линия 3T3-L1 продемонстрировали более высокие уровни цинка, когда размножались доадипоциты, чем когда они были индуцированы или дифференцированы.
Клетки MCF10A показали равные уровни цинка между цитозолическими и ядерными фракциями в размножающихся клетках. Как только клетки MCF10A достигают слияния, было обнаружено снижение уровня цинка в целых клетках на 40%, и было установлено, что металл наиболее сконцентрирован в цитозолической фракции. Графитовая печь атомной абсорбции спектрометрии является весьма чувствительным методом для измерения перехода и тяжелых металлов в биологических и экологических образцов.
Особое внимание и чистоту при подготовке субклеточных фракций следует принимать, так как минимальное загрязнение, скорее всего, помешает анализу, из-за чувствительности оборудования. Учитывая низкие объемы и следовые уровни металлов в каждом эксперименте, трудно придумать лучший и более точный метод измерения цинка, чем GF-AAS. В настоящее время не существует методов, которые могли бы обеспечить пределы обнаружения и низкий объем, требуемый при относительно низкой стоимости GF-AAS.
Графитовая печевая атомная спектрометрия поглощения является точной, чувствительной, рентабельной и доступной. Этот аналитический метод будет продолжать совершенствоваться по мере того, как технологии элементарного обнаружения будут продолжать развиваться. Будущее применение для обнаружения цинка и других металлов GF-AAS будет включать органы, ткани, полученные от животных моделей, и биопсии от пациентов с заболеваниями, связанными с системным дисбалансом металла.
Азотная кислота является чрезвычайно коррозионной кислотой, способной вызвать сильные химические ожоги очень быстро. Это химическое вещество может также реагировать яростно с определенными соединениями, такими как металлические порошки. Из-за опасности, создаваемой азотной кислотой, важно принимать строгие меры безопасности при обращении с азотной кислотой.
При обработке азотной кислоты мы настоятельно рекомендуем вам носить защитные химические очки, щит для защиты от брызг, перчатки и одобренное дыхание пара, если вентиляция не является адекватной.
