Ringraziamo la signora Tess J. Lameyer, la signora Ruth Frank, e il dr. Michael A. Muniak per le modifiche e i commenti, e il dottor Ryohei Yasuda a Max Planck Florida per il software di acquisizione 2pFLIM. Questo lavoro è stato sostenuto da due premi BRAIN Initiative U01NS094247 (H.e T.M.) e R01NS104944 (H. e T.M.), una sovvenzione R01 R01 R01NS081071 (T.M.) e una concessione R21 R21 R21NS097856 (H. ) . Tutti i premi sono dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Stati Uniti.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo dimostra l'uso del sensore FRET-FLIM tAKAR per visualizzare l'attività PKA innescata dalla neuromodulazione nei topi che si comportano con la testa fissa. Questa applicazione si basa su test approfonditi e caratterizzazioni di tAKAR , in vitro e in vivo per dimostrare che il segnale FLIM ottenuto è rilevante per gli eventi neuromodulatori fisiologici17. Qui, un'applicazione in vivo, l'attività PKA indotta dalla locomozione nella corteccia motoria, viene utilizzata per descrive...

La neuromodulazione, nota anche come trasmissione sinaptica lenta, impone un forte controllo sulla funzione cerebrale durante i diversi stati comportamentali, come lo stress, l'eccitazione, l'attenzione e la locomozione1,2,3, 4. Nonostante la sua importanza, lo studio di quando e dove si svolgono eventi di neuromodulatori è ancora agli inizi. Neuromodulatori, tra cui acetilcolina, dopamina, noradrenalina, serotonina, e molti neuropeptidi, attivare G recettori accoppiati a proteina (GPCR), che a sua volta innescano percorsi di messaggeri intracellulari secondo con una vasta finestra di scale temporali che vanno da secondi a ore. Mentre ogni neuromodulatore innesca una serie distinta di eventi di segnalazione, il percorso cAMP/proteina kinase A (PKA) è un percorso a valle comune per molti neuromodulatori1,5. Il percorso cAMP/PKA regola l'eccitabilità neuronale, la trasmissione sinaptica e la plasticità6,7,8,9e quindi sintonizza le dinamiche della rete neuronale. Poiché neuroni o tipi neuronali diversi esprimono diversi tipi o livelli di recettori neuromodulatori10, gli effetti intracellulari dello stesso neuromodulatore extracellulare possono essere eterogenei tra neuroni diversi e, quindi, devono essere studiato con risoluzione cellulare. Ad oggi, rimane difficile monitorare gli eventi neuromodulatori nei singoli neuroni in vivo durante il comportamento.
Per studiare la dinamica spatiotemporale della neuromodulazione, è necessaria una modalità di registrazione adeguata. La microdialisi e la cimmimetria a scansione rapida sono spesso utilizzate per studiare il rilascio di neuromodulatori, ma mancano della risoluzione spaziale per monitorare gli eventi cellulari11,12. Analoga alla dinamica del calcio utilizzata come proxy per l'attività elettrica neuronale nell'imaging della popolazione13,l'imaging PKA può essere utilizzato per leggere eventi neuromodulatori in una popolazione neuronale a risoluzione cellulare. Il presente protocollo descrive l'uso di un activity reporter A-kinase (AKAR) migliorato per monitorare le attività PKA in vivo durante il comportamento animale. Il metodo qui descritto consente l'imaging simultaneo di popolazioni neuronali a risoluzione subcellulare con una risoluzione temporale che tiene traccia degli eventi neuromodulatori fisiologici.
Gli AKAR sono composti da un donatore e da proteine fluorescenti accettatore collegate da un peptide del substrato pkA phosphorylation e da un dominio associato alla forchetta (FHA) che si lega al serino fosforolato o alla treonina del substrato14,15. Al momento dell'attivazione della via PKA, il peptide substrato di AKAR viene fosforato. Di conseguenza, il dominio FHA si lega al peptide del substrato fosforilo, portando così i due fluorofori in stretta vicinanza, indicato come lo stato chiuso dell'AKAR. Lo stato chiuso di un AKAR fosforolato si traduce in un aumento del trasferimento di energia di risonanza del fàrster (FRET) tra il donatore e l'accettatore fluorofori. Poiché la percentuale di ACR al fosforo è correlata al livello di attività PKA16, la quantità di FRET in un campione biologico può essere utilizzata per quantificare il livello di attività PKA16,17,18, 19,20.
Le prime versioni degli AKAR sono state progettate principalmente per l'imaging ratiometrico a due colori14. Quando si immagina più in profondità nel tessuto cerebrale, il metodo ratiometrico soffre di distorsione del segnale a causa della dispersione della luce dipendente dalla lunghezza d'onda17,18,21. Come discusso di seguito, la microscopia per l'imaging a vita di fluorescenza (FLIM) elimina questo problema perché Il FLIM misura solo i fotoni emessi dal donatore fluoroforo18,21. Di conseguenza, la quantificazione FLIM di FRET non è influenzata dalla profondità tissutale17. Inoltre, può essere utilizzata una variante "scura" (cioè bassa resa quantistica [QY]) del fluoroforo dell'accettatore. Questo libera un canale di colore per facilitare la misurazione multiplexata delle proprietà neuronali ortogonali tramite l'imaging simultaneo di un secondo sensore o di un marcatore morfologico17,19,20.
L'imaging FLIM quantifica il tempo che un fluoroforo trascorre nello stato eccitato, cioè la durata della fluorescenza18. Il ritorno di un fluoroforo allo stato di terra, così la fine dello stato eccitato, spesso si contempla con l'emissione di un fotone. Anche se l'emissione di un fotone per una singola molecola eccitata è stocastica, in una popolazione la durata media della fluorescenza è una caratteristica di quel particolare fluoroforo. Quando una popolazione pura di fluorofori è eccitata contemporaneamente, la fluorescenza risultante seguirà un singolo decadimento esponenziale. La costante temporale di questo decadimento esponenziale corrisponde alla durata media della fluorescenza, che in genere varia da uno a quattro nanosecondi per le proteine fluorescenti. Il ritorno di un fluoroforo donatore eccitato allo stato di terra può avvenire anche da PARTE di FRET. In presenza di FRET, la durata della fluorescenza del fluoroforo del donatore è ridotta. Gli AKAsphorylated unphosphorylated mostrano una durata di fluorescenza del donatore relativamente più lunga. Al fosforo della PKA, il sensore presenta una vita più breve perché i fluorofori donatore e accettatore sono portati l'uno vicino all'altro e FRET è aumentato. La quantificazione della durata della fluorescenza in una popolazione di AKAR rappresenta quindi il livello di attività PKA.
Le prime versioni degli AKA non sono state utilizzate con successo per l'imaging in vivo a risoluzione a cella singola. Ciò è dovuto principalmente alla bassa ampiezza del segnale dei sensori AKAR alle attivazioni fisiologiche17. Recentemente, confrontando sistematicamente i sensori AKAR disponibili per la microscopia di imaging a durata della fluorescenza a due fotoni (2pFLIM), è stato scoperto che un sensore chiamato FLIM-AKAR ha sovraperformato i sensori alternativi. Inoltre, una serie di varianti FLIM-AKAR chiamate AKAR mirati (tAKAR) sono state sviluppate per visualizzare l'attività PKA in posizioni subcellulari specifiche: microtubuli (tAKAR), citosol (tAKAR), actina (tAKAR) , actina mentoluta (tAKAR) , membrana (tAKAR) densità postsinaptica (tAKAR). Tra i tAKARR, tAKAR ha aumentato l'ampiezza del segnale suscitata dalla noradrenalina di 2,7 volte. Questo è coerente con la conoscenza che la maggior parte della PKA nei neuroni sono ancorati ai microtubuli allo stato di riposo22,23. il tAKAR è stato il migliore tra gli AKAR esistenti per 2pFLIM. Inoltre, tAKAR ha rilevato un'attività PKA fisiologicamente rilevante suscitata da più neuromodulatori, e l'espressione di tAKAR non ha alterato le funzioni neuronali17.
Di recente, tAKAR è stato utilizzato con successo per visualizzare le attività PKA nei mouse che si comportano alla testa17. È stato dimostrato che la locomozione forzata ha innescato l'attività PKA nel soma dei neuroni a strati superficiali (strato da 1 a 3, fino a una profondità di 300 m da pia) nel motore, nella canna e nelle cortici visive. L'attività PKA innescata dalla locomozione dipendeva in parte dalla segnalazione tramite recettori adrenergici e recettori della dopamina D1, ma non era influenzata da un antagonista del recettore della dopamina D2. Questo lavoro illustra la capacità dei tAKAR di tenere traccia degli eventi di neuromodulazione in vivo utilizzando 2pFLIM.
Nel protocollo corrente, l'intero metodo per l'imaging dell'attività PKA nei topi svegli fissati alla testa durante un paradigma di locomozione forzata è descritto in sei passaggi. In primo luogo, l'aggiunta di funzionalità 2pFLIM a un microscopio convenzionale a due fotoni (Figura 1). In secondo luogo, la costruzione di un tapis roulant motorizzato (Figura 2). In terzo luogo, l'espressione del sensore tAKAR nella corteccia del topo per elettroporazione inutero (IUE) di plasmidi di DNA, o iniezione stereotassica di virus adeno-associato (AAV). Protocolli eccellenti per interventi chirurgici per IUE24,25 e iniezione stereotassica di particelle virali26 sono stati precedentemente pubblicati. I parametri chiave che abbiamo usato sono descritti di seguito. Forth, l'installazione di una finestra cranica. Protocolli eccellenti sono stati precedentemente pubblicati per la chirurgia della finestra cranica27,28. Vengono descritti diversi passaggi che sono stati modificati dai protocolli standard. Quinto, esecuzione in vivo 2pFLIM. Sesto, le analisi delle immagini 2pFLIM (Figura 3 e Figura 4). Questo approccio dovrebbe essere facilmente applicabile a molti altri paradigmi comportamentali fissati alla testa e aree cerebrali.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m cellulose acetate syringe filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>190-2520</td>
			<td>Step 3.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16x 0.8 NA water-immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRP07220</td>
			<td>Step 5.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-pin cable</td>
			<td>US digital</td>
			<td>CA-MIC3-SH-NC</td>
			<td>Step 2.5. To connect rotation sensor to the DAQ input of the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum bread board</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB1012</td>
			<td>Step 2.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnimalTracker MATLAB software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 2.5 and sections 5 - 6. Will be provided upon request to the lead author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass barrier filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET500-40m</td>
			<td>Step 1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Step 2.4. Used as mount for rotation sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon steel burrs for micro drill, 0.5 mm tip diameter</td>
			<td>FST</td>
			<td>19007-05</td>
			<td>Steps 3.2.3. and 4.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular coverslip (5mm diameter)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101413-528</td>
			<td>Step 4.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made injection needle holder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 3.2.4. Technical details provided upon request to the lead author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental acrylic</td>
			<td>Yates Motloid</td>
			<td>44114</td>
			<td>Steps 4.3. and 4.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill; Microtorque ii</td>
			<td>Ram products</td>
			<td>66699</td>
			<td>Steps 3.2.3. and 4.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dowsil transparent polymer</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>3-4680</td>
			<td>Step 4.5. Artificial dura</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation electrode</td>
			<td>Bex</td>
			<td>LF650P5</td>
			<td>Step 3.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bex</td>
			<td>CUY21</td>
			<td>Step 3.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green FCF</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>Step 3.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIMimage MATLAB software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Section 5. Kindly provided by Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIMview MATLAB software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sections 5. and 6. Will be provided upon request to the lead author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam-compatible glue (Gorilla White Glue)</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>5201204</td>
			<td>Step 2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headplate</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 4.3. Technical details provided upon request to the lead author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headplate holder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 2.6. Technical details provided upon request lead author, used in combination with mounting post bracket and right-angled bracket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydraulic micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MO-10</td>
			<td>Step 3.2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>KG82648R</td>
			<td>Step 4.3. Cyanoacrylate-based glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-noise fast photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H7422PA-40 or H10769PA-40</td>
			<td>Step 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB 2012b</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Steps 2.6, and sections 5, and 6. Used to run microscope acquisition and data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor</td>
			<td>Zhengke</td>
			<td>ZGA37RG</td>
			<td>Step 2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor speed controller</td>
			<td>Elenker</td>
			<td>EK-G00015A1-1</td>
			<td>Step 2.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micromanipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-285</td>
			<td>Step 3.2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA1S</td>
			<td>Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with PH4 and TR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P14</td>
			<td>Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with PB2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting post base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PB2</td>
			<td>Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with P14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting post bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>C1515</td>
			<td>Step 2.6. Used in combination with right-angle bracket and headplate holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR2</td>
			<td>Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and PH4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>&#925;/&#913;</td>
			<td>&#925;/&#913;</td>
			<td>Step 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FDS010</td>
			<td>Step 1.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon timing counting module</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td>SPC-150</td>
			<td>Step 1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid: tAKAR&#945; (CAG-tAKAR&#945;-WPRE)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>119913</td>
			<td>Step 3.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post holder</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH4</td>
			<td>Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and TR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AB90</td>
			<td>Step 2.6 Used in combination with mounting post bracket and headplate holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotation sensor</td>
			<td>US digital</td>
			<td>MA3-A10-250-N</td>
			<td>Step 2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber mat</td>
			<td>Rubber-Cal</td>
			<td>B01DCR5LUG</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaft coupling (1/4 inch x 1/4 inch)</td>
			<td>McMaster</td>
			<td>6208K433</td>
			<td>Steps 2.3. and 2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage 3.6</td>
			<td>Svoboda Lab/Vidrio Technology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Steps 5.9. and 6.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal splitter</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td>HPM-CON-02</td>
			<td>Step 1.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel axle (diameter 1/4 inch, L = 12 inch)</td>
			<td>McMaster</td>
			<td>1327K66</td>
			<td>Step 2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic alignment systsem</td>
			<td>David kopf</td>
			<td>1900</td>
			<td>Steps 3.2. and 4.1. modified; Sutter micromanipulator, custom-made injection needle holder, hydraulic micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Section 5. Built based on Modular in vivo multiphoton microscopy system (MIMMS) from HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>14006</td>
			<td>Step 3.2.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus: tAKAR&#945; (AAV2/1 hSyn-tAKAR&#945;-WPRE)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>119921</td>
			<td>Step 3.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White PE foam roller (8 x 12 inch)</td>
			<td>Fabrication enterprises INC.</td>
			<td>30-2261</td>
			<td>Step 2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White polystyrene fom ball halves</td>
			<td>GrahamSweet</td>
			<td>200mm diameter 2 hollow halves</td>
			<td>Step 2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zipkicker</td>
			<td>PACER</td>
			<td>PT29</td>
			<td>Step 4.3. Hardening accelerator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing protein kinase a activity in head-fixed behaving mice using in vivo two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy

Neuromodulazione esercita un potente controllo sulla funzione del cervello. La disfunzione dei sistemi neuromodulatori si traduce in disturbi neurologici e psichiatrici. Nonostante la loro importanza, le tecnologie per monitorare gli eventi neuromodulatori con risoluzione cellulare stanno appena cominciando ad emergere. I neuromodulatori, come dopamina, noradrenalina, acetilcolina e serotonina, innescano eventi di segnalazione intracellulare tramite i rispettivi recettori accoppiati alle proteine G per modulare l'eccitabilità neuronale, le comunicazioni sinaptiche e altri neuronali funzioni, regolando così l'elaborazione delle informazioni nella rete neuronale. I neuromodulatori di cui sopra convergono sul percorso cAMP/protein a chinasi A (PKA). Pertanto, l'imaging PKA in vivo con risoluzione a singola cellula è stato sviluppato come lettura per gli eventi neuromodulatori in modo analogo all'imaging del calcio per le attività elettriche neuronali. Qui, viene presentato un metodo per visualizzare l'attività PKA a livello di singoli neuroni nella corteccia di topi che si comportano alla testa.Here, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mic. A tale scopo, viene utilizzato un giornalista di attività A-kinasi (AKAR) migliorato, chiamato tAKAR, che si basa sul trasferimento di energia di risonanza del Fàrster (FRET). Questo sensore PKA geneticamente codificato viene introdotto nella corteccia motoria tramite elettroporazione in utero (IUE) di plasmidi di DNA, o iniezione stereotassica di virus adeno-associato (AAV). I cambiamenti freT sono immagini utilizzando la microscopia di imaging a vita a durata a due fotoni (2pFLIM), che offre vantaggi rispetto alle misurazioni geometriche FRET per quantificare il segnale FRET nel tessuto cerebrale che disperde la luce. Per studiare le attività della PKA durante la locomozione forzata, tAKAR è immagine attraverso una finestra cranica cronica sopra la corteccia di topi svegli, fissati per la testa, che corrono o poggiano su un tapis roulant motorizzato a velocità controllata. Questo approccio di imaging sarà applicabile a molte altre regioni del cervello per studiare le corrispondenti attività PKA indotte dal comportamento e ad altri sensori basati su FLIM per l'imaging in vivo.

I sensori FRET-FLIM consentono la visualizzazione di molti percorsi di segnalazione diversi, tra cui il percorso cAMP/PKA coinvolto nella neuromodulazione. L'attuale protocollo utilizza il sensore tAKAR, sviluppato di recente, in combinazione con 2pFLIM per visualizzare le attività PKA nei mouse che si comportano con la testa fissa. La maggior parte dei microscopi a due fotoni esistenti può essere aggiornata con capacità 2pFLIM aggiungendo da tre a quattro componenti, come illustrato n...

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Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Viene presentata una procedura per visualizzare le attività della chinasi proteica A nei topi con problemi alla testa e che si comportano. Un giornalista di attività A-kinase migliorato, tAKAR, è espresso in neuroni corticali e reso accessibile per l'imaging attraverso una finestra cranica. La microscopia di imaging a durata della fluorescenza a due fotoni viene utilizzata per visualizzare le attività PKA in vivo durante la locomozione applicata.

Visualizzazione della proteina Kinase un'attività nel mouse behaving fissato per la testa utilizzando la microscopia fluorescenza a due fotoinina in vivo

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...

Il nostro metodo utilizza una nuova protein chinasi Un sensore chiamato bersaglio A chinasi attività reporter alfa, o tAKAR

visualizing-protein-kinase-activity-head-fixed-behaving-mice-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K Views.  Oregon Health & Science University. Il nostro metodo utilizza una nuova protein chinasi Un sensore chiamato bersaglio A chinasi attività reporter alfa, o tAKAR